红景天苷对力竭大鼠心肌线粒体生物发生关键调控因子的影响

崔玉娟，张龙飞，平 政，曹雪滨

线粒体是真核细胞进行氧化代谢产生能量的场所，对心肌收缩功能的维持起着至关重要的作用。冷暴露、饥饿、运动等刺激会诱导线粒体数量增加和功能改变，即线粒体生物发生［1］。线粒体生物发生能够提高细胞的能量代谢能力，从而满足心肌持续收缩所需能量。目前研究表明线粒体生物发生的主导协调因子——过氧化物酶增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α(Peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator 1α，PGC-1α)在线粒体活动中发挥了中心作用，它是控制线粒体生物发生转录通路上游的调节共激活因子，能通过强烈地诱导核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor-1，NRF-1)和核呼吸因子-2(nuclear respiratory factor-2，NRF-2)基因的表达刺激线粒体生物合成，因此，PGC-1α-NRF-1-NRF-2是调控线粒体生物发生的关键级联信号通路［2］。运动是一种病理生理刺激，适度运动能够诱导 PGC-1α、NRF-1、NRF-2 的表达［3］，从而刺激线粒体生物发生。而力竭运动会对机体心脏功能造成负面影响，引起线粒体功能障碍［4］，但其分子机制是否与线粒体生物发生有关尚不明确。红景天苷(Salidroside，SAL)是中药红景天中的主要有效成分之一，具有抗心肌缺血缺氧、抑制心肌细胞凋亡、促进血管再生、抗动脉粥样硬化等作用［5-7］。本实验拟通过研究SAL对力竭大鼠心肌线粒体生物发生关键调控因子 PGC-1α、NRF-1、NRF-2在不同时相的表达，为SAL的临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 清洁级SD雄性大鼠104只［军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号:SCXK(京)2003-1-003］。98%提纯红景天苷粉(南京泽朗植提技术有限公司)，兔抗PGC-1α抗体、兔抗NRF-1抗体及兔抗NRF-2抗体(英国Abcam公司)，兔抗β-Actin抗体(美国CST公司)，HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)(中国中杉金桥公司)。凝胶成像系统 Fluor Chem E(美国 Cell Biosciences公司)。Image J 1．44图像分析软件(National Institutes of Health)。

1.2 方法

1.2.1 分组:将104只SD大鼠随机分对照(C)组、力竭(EE)组、低剂量SAL力竭(LS)组、高剂量SAL力竭(HS)组，对照组8只，其余组分4个时间点即即刻、6 h、12 h、24 h 观察，每个时间点8 只。

1.2.2 造模及取材:C及EE组给予生理盐水10 ml/kg灌胃 2周，LS和 HS组给予 SAL 100、300 mg/kg灌胃2周。EE、LS和HS组灌胃结束后分别予以建立一次性力竭游泳模型，C组无需特殊处理。一次性力竭游泳模型建立方法:使用塑料圆桶(高60 cm、直径55 cm)作为大鼠的游泳场地，注意保证水的清洁，水深约 50 cm，水温保持在(32.0±0．5)℃。模型建立前大鼠均进行适应性的无负重游泳练习，每次10 min，造模前大鼠需禁食12 h，造模时大鼠尾部负为体重3%的铅块。一次性力竭游泳运动所达到的力竭状态参考Thomas力竭标准［8］:①大鼠超过10 s沉入水下后无法再返回水面;②大鼠的协调运动消失，出现了无方向性的乱窜，虽少于10 s亦可定为大鼠已力竭。对于短时间(2 h)内就出现了运动不协调的大鼠，将其捞出休息5 min后，继续进行游泳运动至其力竭。达到力竭标准后，将大鼠捞出，吹干皮毛，并记录结束时间。力竭后即刻、6、12、24 h，立即摘除3个模型组大鼠心脏，去除心房，于缓冲液中洗去心脏残留血渍，装入2 ml离心管中，做好标记，置于液氮中冷冻后于－80℃冰箱中保存。同时期相同方法处理 C组大鼠。

1.3 观察指标

1.3.1 大鼠一般状况及游泳时间:观察3个模型组力竭运动前后的一般状况，记录并比较EE、LS、HS组力竭游泳时间。

1.3.2 大鼠心肌 PGC-1α、NRF-1、NRF-2的蛋白表达测定:以 β-actin作为内参。提取心肌蛋白，用BCA蛋白测定法测定蛋白浓度。取15μg蛋白质样品行SDS-PAGE电泳，电泳后转移至PVDF膜，1%脱脂奶粉稀释一抗 PGC-1α、NRF-1、NRF-2、β-actin分别按照1∶1000、1∶500、1∶500、1∶1000 的比例稀释4℃孵育过夜，漂洗3次，HRP标记山羊抗兔IgG按照1∶10 000的比例稀释，漂洗3次。使用ECL试剂盒发光显影，放入凝胶成像系统 Fluor Chem E中曝光显影，使用Image J 1．44图像分析软件计算蛋白表达量。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13．0软件进行统计学分析，所有数据均用均数±标准差(x±s)表示。各组间数据符合正态、方差齐(α＞0．1)时采用单因素方差分析，方差不齐时采用Dunnertt法，α=0．05为检验水准。

2 结果

2.1 一般状况及游泳时间 各模型组大鼠力竭运动前活动自如，皮毛光亮，一般状况可;力竭游泳运动后表现为极度疲劳的状态:呼吸急促，运动迟缓，对刺激的反应不灵敏，部分动物甚至出现了结膜充血、血尿等征象。EE、LS及HS组游泳时间分别为(500．8 ± 18．0)、(580．9 ± 17．5)、(675．9 ±20．2)min，LS及HS组游泳时间较EE组明显延长(P＜0.05)，HS组游泳时间较LS组明显延长(P＜0.05)。

2.2 各组心肌蛋白表达量比较

2.2.1 心肌PGC-1α蛋白表达量:EE、LS及HS组PGC-1α蛋白表达量均为即刻最低，6 h最高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与C组比较，EE组各时相心肌PGC-1α蛋白的表达量均降低(P＜0.05)。与相同时相的EE组比较，LS组即刻、6、24 h，HS组各时相心肌PGC-1α蛋白表达量均显著增高(P＜0.05)。与相同时相的LS组比较，HS组即刻、24 h PGC-1α蛋白的表达量显著降低，6、12 h显著增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1、图1。

2.2.2 心肌NRF-1蛋白表达量:各组不同时相心肌NRF-1蛋白表达比较，LS组6 h表达量最高，即刻表达量最低;HS组6 h表达量最高，24 h表达量最低。与C组比较，EE组即刻、6 h、24 h心肌NRF-1蛋白表达量显著降低(P＜0.05)。与相同时相的EE 组比较，LS组6、12、24组，HS组即刻、12 h心肌NRF-1蛋白表达量显著增高(P＜0.05)。与相同时相的LS组比较，HS组各时相心肌NRF-1蛋白表达量均显著降低(P＜0.05)。见表1、图1。

2.2.3 心肌NRF-2蛋白表达量:EE、LS及HS组NRF-2蛋白表达量均为12 h表达量最高，即刻表达量最低(P＜0.05)。与C组比较，EE组即刻、6 h、24 h心肌NRF-2蛋白表达量显著降低(P＜0.05)。与相同时相的EE组比较，LS组即刻、6 h、12 h，HS组各时相心肌NRF-2蛋白表达量均显著增高(P＜0.05)。与相同时相的LS组比较，HS组6、12、24 h心肌NRF-2蛋白表达量均显著增高(P＜0.05)。见表1、图1。

3 讨论

在真核生物体内，细胞呼吸、能量产生及其他代谢过程均发生在线粒体内。线粒体是细胞代谢活动的重要调节器，是真核生物的糖、脂肪和氨基酸进行氧化最终释放能量的场所。力竭运动后心肌耗氧量增加，细胞内三磷腺苷(ATP)减少，影响细胞内各种生化反应的进行，从而使心肌正常功能受到损害。PGC-1a作为线粒体生物合成的关键调节因子，对维持生物活动的能量平衡起到重要的生理意义［9］。Ventura Clapier等［10］通过对降低心肌氧化能力在心脏衰竭的发病机制中作用的研究表明，心脏及骨骼肌在压力超负荷下由于PGC-1a及其下游的NRF-2等因子的表达下调而引起线粒体功能减弱。本研究结果显示，所有力竭运动后大鼠的PGC-1α、NRF-1和NRF-2的蛋白表达量均低于对照组，表明力竭运动会降低心肌线粒体的功能。此外，很多研究表明在接触外源性氧化应激［11-13］或应答氧化损伤［14］时，线粒体生物生成会增加。本研究中各组PGC-1α和NRF-2蛋白均在力竭后即刻的表达量最低，随时间延长蛋白表达量有所升高，PGC-1α在6 h升到最高，NRF-2在12 h达高峰，无进一步升高趋势。表明线粒体生物发生是力竭大鼠应对心肌缺血缺氧的氧化应激反应。

表1 各组大鼠心肌PGC-1α、NRF-1、NRF-2蛋白表达量比较(x±s)

图1 各组大鼠心肌PGC-1α、NRF-1、NRF-2蛋白表达PGC-1α．过氧化物酶增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α，NRF-1．核呼吸因子-1，NRF-2．核呼吸因子-2;C组．对照组，EE组．力竭组，LS组．低剂量红景天苷力竭组，HS组．高剂量红景天苷力竭组

红景天是多年生草本植物，多生长于亚洲的高海拔地区与欧洲北极地区的干燥沙地，在恶劣的生长环境中表现出耐寒、耐干旱、耐强紫外线照射等特性，这表明红景天对环境的适应能力很强，生命力非常旺盛。作为红景天主要活性物质SAL的临床药用价值很高，尤其在心血管疾病治疗方面，近些年来对其研究越来越多。有研究表明，SAL对缺氧诱导的心肌细胞损伤有保护作用［15］。杨雷等［16］的研究表明，SAL能促进心肌梗死后大鼠心肌组织血管的再生。而本研究中LS及HS组力竭游泳时间均明显高于EE组，说明SAL能够增强大鼠的运动耐力。LS组PGC-1α、NRF-1和 NRF-2及 HS组的 PGC-1α和NRF-2蛋白表达量显著高于EE组，说明SAL能够上调线粒体生物发生调节关键因子PGC-1α和NRF-2的表达，低剂量SAL能够上调NRF-1的表达，从而刺激线粒体的生物发生，对力竭运动产生的心肌损伤起保护作用。但HS组的NRF-1蛋白表达未见上调，可能是高剂量SAL通过对其他因子的调节影响了NRF-1的蛋白表达，具体机制仍需进一步研究。

综上所述，力竭运动会造成心肌损伤，影响线粒体的功能，而SAL能通过刺激线粒体的生物发生形成对心肌的保护作用。SAL具有很好的开发前景，但其对心脏疾病的作用机制尚未完全清楚，仍需深入研究。

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