无创DNA产前检测在筛查胎儿非整倍体染色体病的应用

郭伟诚 林惠玲

1 澳门塔石卫生中心； 2 澳门黑沙环卫生中心

近年来，随着社会模式和观念的改变，女性在社会上拥有事业的发展和经济独立的能力，因此，女性婚育年龄有上升的趋势，妇女生育年龄的上升除增加妊娠并发症的风险外，也提高了出生缺陷的风险，以21－三体综合征为例，怀有染色体异常胎儿的风险随孕妇年龄的增长而提高，数据显示，在20～24岁之间，患病率为1／1 400，～35岁为1／350，～40岁为1／100，～45岁或以上为1／25［1］。传统结合血清学和超声影像学检查的无创联合筛查虽然敏感性高但假阳性也较高，不少筛查阳性孕妇实际上进行了不必要的有创性诊断检查，因而为孕妇带来心理负担和操作相关的流产风险。因此，临床上需要一种无创而可靠的产前检查方法。本文将以新近研究和应用的无创DNA产前检测方法进行综述。

1 非整倍体染色体病的简介

染色体病（Chromosomal disease）是指由于先天性的染色体数目异常或结构畸变而引起的疾病。染色体异常是导致出生缺陷的重要原因。数据显示，约160例新生儿中就有1例是染色体异常患者［2］。在众多染色体异常中，以非整倍体染色体病所导致的残障及生活障碍尤为显著。非整倍体（aneuploid）是指其染色体的数目并非单倍体（haploid）的整倍数，而是在数目上出现多于或少于整倍体，如45或47条染色体。常见的非整倍体患者是某对染色体不是2条而是出现3条，称为三体综合征（Trisomic syndrome）。如果某对染色体缺少1条，则称为单体综合征（Monosomic syndrome）。染色体异常常表现为具有多种畸形的综合征，这些综合征表现为多发性畸形、智力低下和生长发育迟缓，此外，还可表现为一些特征性的皮肤纹理改变。染色体畸变可导致死胎或流产，在自然流产胎儿中有20%～50%是由染色体异常所致。

目前已发现的人类染色体数目异常和结构畸变有10 000多种，已确定或已描述过的综合征有100多种。染色体病一般分为常染色体病和性染色体病两大类。常染色体病是指涉及第1～22号常染色体异常引起的染色体病。数据显示，常染色体病的发生率可高达1／160例新生儿［2］。21－三体综合征（Down综合征，T21）、18－三体综合征（Ewards综合征，T18）和13－三体综合征（Patau综合征，T13）是三个最常见的常染色体非整倍体染色体疾病。其中以21－三体综合征最为常见，发病率为1／800［2］。性染色体病是指涉及X、Y性染色体异常引起的染色体病。数据显示，性染色体病的发生率为1／500例新生男婴和1／850例新生女婴［3］。Turner综合征（45，X）和Klinefelter综合征（47，XXY）是临床上比较常见的性染色体病。

2 产前诊断非整倍体染色体病的现状

对于非整倍体染色体病，目前仍缺乏有效的治疗方法，因此，利用产前筛查找出患病胎儿并采取选择性流产以达到降低出生缺陷发生率的方法已成为预防的重要手段，对于选择继续怀孕的夫妇，提早诊断可让家长为患儿出生后的照顾和将来的培育作出提前的计划和准备。目前产前诊断方法分为无创性和有创性两大类。无创性检查包括血清学、超声诊断学检查以及两者联合筛查。孕中期通过孕妇血清标志物甲胎蛋白（AFP）、游离雌三醇（μE3）及人绒毛膜促性腺激素（β－HCG）进行三联血清学筛查是目前国内比较广泛应用于临床的产前筛查模式，由于是通过孕妇血清标志物水平间接反应胎儿的情况，因此存在敏感性（70%）不足和一定的假阳性率（5%）［4］。孕早期利用超声波进行胎儿颈后透明带检查结合包括人绒毛膜促性腺激素（β－HCG）和妊娠相关血浆蛋白A（PAPP－A）的血清学检查进行联合筛查虽然可提高筛查的敏感性（90%）［5］，但颈后透明带扫描的准确度受多种因素影响，包括操作者的技术水平和所使用的扫描仪器的精确度。有创性检查包括绒毛、羊水和脐血细胞培养和核型分析检查，是目前产前诊断非整倍体染色体疾病的金标准，但有创性检查存在一定的流产风险（≤1%）［6，7］，在实际操作中给孕妇及其家属带来极大的心理负担。虽然，通过筛查约有3%～5%孕妇被视为高危并需要进行有创性检测，但实际上染色体异常的发病率远低于此值，因此，不少孕妇进行了不必要的有创检查。如何降低假阳性率和提高准确率以减少不必要的有创检查一直是研究者们努力的方向。随着分子遗传学的快速发展，无创性产前诊断越来越受到临床的重视和研究。

3 无创DNA产前检测的基本原理

无创DNA检测技术最早起源于母体外周血中胎儿游离DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）片段的发现。1997年香港中文大学的卢煜明教授等发现母体外周血中存在Y染色体片段，经过进一步PCR扩增技术获得Y染色体的特异性DNA序列，因而确认怀有男性胎儿的母体血中存在胎儿cffDNA［4］。无创产前基因检测技术开拓了筛查胎儿非整倍体染色体病新的发展方向。胎儿染色体异常会带来母体中DNA含量的微量变化，通过深度测序及生物信息可分析检测到该变化，为项目提供理论依据。cffDNA主要来源于胎盘滋养层细胞，它自妊娠7周左右胎儿胎盘循环建立后即以一定比例存在于母体外周血循环中，母体血循环中约10%～15%的cffDNA来自胎儿［8］，其含量随妊娠周数的增大而增多，而在分娩后2h即完全降解［4］，因此，它可以反映是次妊娠的胎儿情况。以21－三体综合征为例，怀有患病胎儿的母体血中存在超量的21号染色体片段，但这种变化非常微小，需要利用灵敏的方法进行检测。随着分子生物学技术的成熟，目前，无创DNA产前检测（Noninvasive prenatal testing，NIPT）是利用大规模平行测序技术（Massively parallel sequencing，MPS）对母体外周血中的cffDNA（包含胎儿cffDNA）进行深度测序，利用生物统计学方法将测序结果进行生物信息分析，可以从中获得胎儿的遗传信息，并根据分析结果评估胎儿患非整倍体染色体病的风险。

4 无创DNA产前检测的技术现状

21－三体综合征、18－三体综合征和13－三体综合征T21、T18和T13是三个比较常见的非整倍体染色体病，其发病率分别为1／800、1／6 000和1／10 000，因此，无创DNA产前检测目前主要集中在该三项非整倍体病的检测研究。目前还没有足够的研究资料说明它在诊断其他染色体病的应用价值。自2011年起，各国陆续发表了他们在无创DNA产前检测非整倍体染色体病的研究结果，整合分析示T21、T18和T13的无创DNA产前检测准确率分别高达到99.4%、97.4%和92.5%，而假阳性率则分别低至0.2%、0.5%和0.8%［9］。尽管无创DNA检测具有准确率高和假阳性率低的特点，但它并非确诊性检查，阳性检测结果仍需进行有创性检查进一步确诊。然而，阴性结果可减少高危孕妇进行不必要的有创检查。

理论上说，胎儿cffDNA的检测还可以应用于性染色体和其他非整倍体染色体病的检测，但对于其他罕见的染色体数目异常、嵌合体、易位型和微缺失微重复的相关研究报道仍较少，因此针对少见染色体病的检测仍需要进一步研究分析。研究指出，该检测对胎儿性别鉴定的准确率达到99%以上［10］，但由于非医学目的的胎儿性别鉴定并非常规检测项目，而且抵触于我国法律，因此，该技术仍未在我国进行临床应用。由于目前有关无创DNA检测的主要研究对象为自然受孕妇女，对于辅助生殖下怀孕的妇女，目前该技术的应用仍需要进一步的研究证据。

5 无创DNA产前检测的特点和适应证

对于孕妇来说，无创DNA检测是一项简单的血清学检查，只需要抽取5ml的母体静脉血而无须空腹进行。该操作可避免于有创检查所带来的胎儿宫内感染和流产的风险。由于目前有关无创DNA产前检测的研究主要集中于高危单胎妊娠妇女，因此，对于风险较低和多胎妊娠妇女，它的应用价值仍欠缺相关的研究数据支持。作为产前筛查，无创DNA检测应在充分的产前咨询和风险评估后的一项选择性检查。一般建议最佳检测时间为妊娠12～24周，而且应在孕早期超声检查确定妊娠周数和排除多胎妊娠后进行。它不能取代孕早、中期的超声波检查和血清学检查在筛查开放性神经管畸形和胎儿结构性异常等方面的应用。无创DNA产前检测主要适用于以下情况：（1）孕妇在预产期年龄≥35岁；（2）胎儿超声检查结果显示非整倍体的风险增加；（3）既往妊娠中曾怀有三体综合征胎儿；（4）产前筛查包括孕早期超声检查、血清学检查或联合筛查结果显示为高危者；（5）亲代为13、21号染色体的平衡易位携带者［11］。

6 无创DNA产前检测的发展现状

无创DNA产前检测还未成为我国有关医疗部门公认的标准。虽然，大多数医院都未能普及进行该项检测，目前能够提供该技术的医院主要分布在一、二线城市的三甲医院，但有陆续开展该检测项目和逐渐普及的趋势。将来该技术还可能应用于胎儿染色体微缺失微重复、单基因病甚至全基因组的无创基因检测［9］。

7 总结

产前筛查其中一个主要目的是提早发现非整倍体胎儿，传统无创性血清学和超声影像学检查存在敏感性不足和假阳性率高的问题。近年来，母体外周血中胎儿游离DNA片段的发现为无创产前基因检测开展了新的方向。无创DNA产前检测是一项主要应用于21－三体综合征、18－三体综合征和13－三体综合征的新检测技术。它具有准确率高和假阳性率低的特点。它主要适用于预产期年龄≥35岁的高危单胎妊娠和其他产前筛查结果提示为高危的孕妇。它不能取代孕早、中期的超声影像学和血清学筛查的应用，并应在充分的产前咨询和风险评估后作为选择性的检测。由于它并非确诊性检查，阳性检测结果仍需进一步进行有创性检查确诊。目前该检测虽然未被普及应用，但随着检测技术的提高和检测成本的降低，相信具有很大的发展潜力。

［1］ Ernest B.Hook，Philip K.Cross，et al.Chromosomal Abnormality Rates at Amniocentesis and in Live－Born Infants〔J〕.JAMA，1983，249（15）：2034－2038.

［2］ Driscoll DA，Gross S.Clinical practice.Prenatal screening for aneuploidy〔J〕.N Engl J Med，2009，360（24）：2556－2562.

［3］ Jiang F，Ren J，Chen F，et al.Noninvasive Fetal Trisomy（NIFTY）test：an advanced noninvasive prenatal diagnosis methodology for fetal autosomal and sex chromosomal aneuploidies〔J〕.BMC Medical Genomics，2012，5：57.

［4］ 边旭明.胎儿染色体非整倍体的无创DNA产前检测〔J〕.实用妇产科杂志，2013，29（5）：330－333.

［5］ 邵俊梅，秦莉.无创DNA产前检测——新型无创唐筛方法〔J〕.中国优生优育，2013，19（4）.

［6］ Eddleman KA，Malone FD，Sullivan L，et al.Pregnancy loss rates after midtrimester amniocentesis〔J〕.Obstet Gynecol，2006，108（5）：1067－1072.

［7］ Rhoads GG，Jackson LG，Schlesselman SE，et al.The safety and efficacy of chorionic villus sampling for early prenatal diagnosis of cytogenetic abnormalities〔J〕.New England Journal of Medicine，1989，320（10）：609－617.

［8］ Ashoor G，Syngelaki A，Wagner M，et al.Chromosome－selective sequencing of maternal plasma cell－free DNA for first－trimester detection of trisomy 21and trisomy 18〔J〕.Am J Obstet Gynecol，2012，206：322.e1－5.

［9］ 张磊，王威.无创产前基因检测胎儿染色体非整倍体技术研究及应用进展〔J〕.中国产前诊断杂志：电子版，2012，4（3）：32.

［10］ Chiu RW，Akolekar R，et al.Non－invasive prenatal assessment of trisomy 21by multiplexed maternal plasma DNA sequencing：large scale validity study〔J〕.BMJ，2011，342：c7401.

［11］ Noninvasive prenatal testing for feta aneuploidy.Committee Opinion No.545.American College of Obstetricians and Gynecologists〔J〕.Obstet Gynecol，2012，120：1532－1534.