牙髓干细胞治疗脊髓损伤的研究进展

陈海聪(综述)，曾 荣，胡资兵(审校)

(广东医学院附属医院骨科，广东 湛江 524000)

脊髓损伤后可导致严重的机体功能紊乱甚至瘫痪或死亡，由于中枢神经不可再生，该病治疗结果不太理想。随着干细胞理论的发展，研究者发现干细胞移植疗法在脊髓损伤修复中具有重大潜能，不仅能减少脊髓细胞的凋亡，还可促进患者损伤后功能的恢复[1-3]。目前胚胎干细胞[4]、脐带血干细胞[5]、神经干细胞[6]及间充质干细胞[7]等被应用于脊髓损伤的细胞治疗，并且取得了一定疗效。自2000年以来，牙髓干细胞逐渐被人们所认识。牙髓干细胞同拥有间充质干细胞及神经嵴干细胞的特性，能分化为神经细胞以及其他类型的细胞，可作为一种新的种子干细胞用于脊髓损伤的治疗。

1 牙髓干细胞

1.1牙髓干细胞的定义 干细胞是一类能自我复制，并且能够分化成特定细胞类型的细胞[8]。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞[9]。2000年Gronthos等[10]利用酶消化法培养人第三磨牙牙髓组织，得到了有细胞克隆能力及高度增殖能力的细胞，通过和骨髓间充质干细胞的对比研究，发现牙髓细胞具有与骨髓间充质干细胞极其相似的免疫表型及形成矿化结节的能力，同时还具有分化形成牙本质及髓样复合物的能力，从而提出了牙髓干细胞的概念。目前为止，有5种干细胞被证明存在于牙齿中，分别为牙髓干细胞[10]、脱落乳牙干细胞[11]、端突干细胞[12]、韧带周围干细胞[13]和牙囊祖细胞[14]。以上5种干细胞均具有自我更新和多向分化能力，并有较强的克隆能力。

1.2牙髓干细胞的表面标记 明确干细胞表面分子标记是分离鉴定干细胞的重要手段。对于牙髓干细胞，目前仍缺乏特异性标记。来自中胚层细胞的标志物基质细胞抗原(STRO-1)及CD146在牙髓干细胞中均有表达，它们可用于牙髓干细胞未分化状态的鉴定。多个实验发现牙髓干细胞与骨髓间充质干细胞有极其相似的细胞表型[10,15-16]。免疫组织化学及流式细胞仪技术分析表明，牙髓干细胞可表达一系列间充质干细胞标志物(如CD29、CD90、CD73、CD105)及表达部分神经标志物(如巢蛋白、β微管蛋白Ⅲ、神经元核抗原、胶质纤维酸性蛋白、S100)，但不表达内皮及造血标志物(如CD14、CD34、CD45、CD11b、人白细胞DR抗原)[11,15]。

1.3牙髓干细胞的生物学特性

1.3.1自我更新能力 干细胞的自我更新及增殖能力的重要标准是单一细胞的克隆形成率[17]。Gronthos等[10]对牙髓干细胞及骨髓间充质干细胞的比较发现，牙髓干细胞在培养14 d后较骨髓间充质干细胞具有更强的克隆形成率。此外，有学者发现猕猴牙髓干细胞培养14 d后克隆形成率达到90%，证明牙髓干细胞在体外有明显的更新及增殖能力[18]。

1.3.2多重分化能力 牙髓干细胞具有多重分化能力，不仅能够分化成牙质细胞，还能向脂肪细胞、神经细胞、成骨细胞及软骨细胞分化。还有学者发现大鼠牙髓干细胞在一定条件下能够分化成软骨细胞，并且他们通过形态学、分子学及生物化学也证明了这一点[19]。

1.3.3免疫调节能力 如骨髓间充质干细胞一样，牙髓干细胞拥有强大的免疫调节能力。Yamaza等[20]通过动物实验证明，牙髓干细胞具有免疫调节作用，移植牙髓干细胞能够逆转系统性红斑狼疮相关性紊乱，它们主要通过抑制辅助性T细胞17起作用。

2 牙髓干细胞治疗脊髓损伤

2.1牙髓干细胞治疗脊髓损伤的特点 作为临床应用的理想干细胞来源，应当满足一定的标准，如容易获取、伦理上容易接受、安全的生物学性能、费用合适及具有近期、远期治疗效果。牙髓干细胞具有的特点[21]：来源广泛、容易取得、无创；相对于其他成体干细胞，分离提取安全、容易；拥有间充质细胞特性同时也具有神经细胞特性，可以分化成为功能神经元；具有神经保护作用；能够长期低温储存；伦理上无争议。

2.2牙髓干细胞治疗脊髓损伤的理论基础——体外神经分化 作为来源于神经嵴细胞的牙髓干细胞，已被证明能表达多种神经细胞标志物，说明其具有向神经细胞分化的潜能，相对于其他类型的干细胞，其具有更加明显的神经分化能力[11,15]。2004年，美国及瑞典学者发现牙髓干细胞能够产生多种神经营养因子(如神经生长因子、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子)，能够促进多巴胺神经的存活，同时发现牙髓干细胞能分化成神经细胞，可应用于中枢神经系统疾病的治疗[22]。2008年，有学者发现在一定的神经诱导条件下，牙髓干细胞能够形成神经元的形态，并在基因及蛋白水平下表达神经元标志物，展现出能够产生与功能性神经细胞相符合的钠电流能力，甚至把牙髓干细胞移植至中脑后也发现其具有神经元的形态及表达神经标志物，这些证据说明牙髓干细胞具有治疗神经系统疾病的潜能[23]。2011年，有学者发现在一定的生长因子作用下，免疫荧光及流式细胞仪检测发现牙髓干细胞很快就表达神经细胞早期标志物(巢蛋白及β微管蛋白Ⅲ)，随后表达中期及成熟神经细胞标志物，同时实时聚合酶链反应及蛋白质印迹检测也发现各种神经标志物明显上调[24]。干细胞修复脊髓损伤主要通过以下途径：替代受损神经细胞；通过释放生长因子促进神经再生。以上实验表明，牙髓干细胞在一定的作用条件下，能够分化为功能神经细胞，起到神经替代作用，同时也能分泌神经营养因子，激活体内处于休眠及受损的神经细胞，实现神经保护功能。牙髓干细胞诱导分化为神经细胞的分子机制与信号调控通路尚不清楚。

2.3牙髓干细胞治疗脊髓损伤的应用——动物实验 目前，脊髓损伤修复的研究主要围绕以下几个方面进行[25]：诱导受损的神经纤维再生，如直接给予多种神经生长因子促进其表达，为再生轴突提供桥梁；填充空洞和消除瘢痕组织；去除轴突生长抑制因子、髓磷脂相关糖蛋白与少突胶质细胞-髓磷脂糖蛋白等抑制轴突生长的因素。上述方法的临床疗效尚不理想，近年来随着干细胞研究的发展及进步，干细胞开始应用于神经再生医学领域，并取得了一定效果。牙髓干细胞作为新的种子干细胞也开始被应用于脊髓损伤的修复。

最初，研究者发现给脊髓半切模型的大鼠移植大鼠牙髓组织，然后通过荧光金标记法检测运动神经元的变化，发现移植牙髓组织的大鼠运动神经元存活量显著高于对照组，约增高115%倍，他们还发现移植的牙髓组织表达的胶质细胞源性神经营养因子显著增高，表明移植的牙髓细胞主要通过分泌神经营养因子促进运动神经元细胞的存活[26]。从Gronthos发现牙髓干细胞的存在以来，经过10余年的发展，牙髓干细胞的研究愈加深入，已经被科学家应用于组织工程研究，如骨缺损修复、牙齿的修复，当然也包括中枢神经系统疾病[27-28]。2011年有科学家称，通过移植未分化人脱落乳牙干细胞能够促进急性脊髓损伤大鼠功能恢复，发现移植牙髓干细胞向神经元细胞及胶质细胞分化及增殖[29]。研究人员发现移植牙髓干细胞能够通过多重神经再生机制，促进脊髓横断大鼠后肢功能的恢复，作用机制包括抑制脊髓损伤导致的神经细胞凋亡；通过抑制多重轴突生长抑制因子的作用促进轴突的再生；牙髓干细胞能够分化成成熟少突胶质细胞，起到神经替代作用[15]。从牙髓组织移植治疗脊髓损伤到牙髓干细胞治疗脊髓损伤，在动物实验中均取得了显著效果，能够改善动物的运动能力，表明牙髓干细胞可作为治疗脊髓损伤不可或缺的干细胞来源。在进入人体应用之前，还需要更多的实验明确牙髓干细胞在脊髓修复中的作用机制。

3 牙髓干细胞库

牙髓干细胞库的构建包括三个步骤：牙齿的收集、牙髓干细胞的分离及牙髓干细胞的贮藏。这些步骤简单而相对无创，在低温贮藏后牙髓干细胞仍然具有明显的自我增殖及多向分化能力[30]。乳恒牙替换是一个正常的生理现象，相对其他干细胞的来源，从牙髓中获取干细胞能避免伦理学争议。从脱落的乳牙牙髓中分离培养干细胞用于贮藏，构建“牙髓干细胞库”是可行的。牙髓干细胞能分化成多种细胞，可应用于多种疾病的治疗，包括神经退行性病变、脊髓损伤、糖尿病、心血管疾病、免疫性疾病及骨骼肌肉疾病等。在患者年轻及健康时，贮藏他们的牙髓干细胞是必要的。牙髓干细胞库在发达国家应运而生。

世界上第一家牙髓干细胞库首先出现于美国，总部设在奥斯汀的美国BioEden公司，同时在英国及泰国建立了他们的国际实验室，并且向澳大利亚、俄罗斯、印度及中东地区进行推广。目前，牙髓干细胞库在发达国家开始流行。日本广岛大学成立了日本首家牙髓干细胞库，紧接着名古屋大学也成立了他们的牙髓干细胞库。2008年，台北医科大学与日本广岛大学合作成立了台湾地区首家牙髓干细胞库，同年挪威也成立了他们的牙髓干细胞库[31]。目前我国的牙髓干细胞库正处于开始时期，有待进一步发展。

4 牙髓干细胞研究前景

2004年的调查显示，全球范围内接近有600万脊髓损伤患者，每年每100万人就有15～40新增病例[32]。2009年时，美国大概有100万脊髓损伤患者，每年新增1.2万病例[33]。2010年加拿大的调查显示，整个国家约有85万脊髓损伤患者，每年新增约3700病例[34]。牙髓干细胞是存在于牙髓组织中的成体干细胞，可分化形成多种细胞类型，牙髓干细胞具有重要的治疗潜力。牙髓干细胞已应用于牙齿及颅面细胞的重建。目前研究认为，牙髓干细胞将有望应用到更加广泛的医学再生领域，尤其是治疗中枢神经系统相关疾病，包括脊髓损伤。牙髓干细胞分离、提取方便，保存容易，价格便宜，许多发达国家已经建立了“牙髓干细胞库”[31]。牙髓干细胞是脐带血干细胞的补充，能够修复结缔组织、牙质组织、神经组织及骨组织。作为一种成体干细胞，牙髓干细胞避免了像胚胎干细胞方面的伦理学争论[31]。我国应当尝试建立自己的“牙髓干细胞库”。

相对于其他干细胞，目前对牙髓干细胞的研究较少，起步较晚，还有许多问题需要解决。首先，目前牙髓干细胞缺乏明确的标志物，其分离鉴定难度大；其次，牙髓干细胞向神经细胞的分化机制尚未明确，还待进一步阐明；最后，牙髓干细胞治疗脊髓损伤的时机选择、用量选择及使用部位选择等需要进一步明确。这些问题还需要深入的探讨及解决，只有牙髓干细胞的研究日趋完善，其应用于临床才能逐渐实现。

5 小 结

脊髓损伤治疗仍然是世界性难题，干细胞移植治疗带来了新的希望。作为来源于神经嵴细胞的牙髓干细胞，更容易分化为神经细胞。多个动物实验证明，牙髓干细胞能够在脊髓中迁移并且分化为神经细胞，改善动物的运动功能[15,29]。然而，牙髓干细胞治疗脊髓损伤仍然面临着巨大挑战：如何获取大量性质稳定的牙髓干细胞；牙髓干细胞治疗脊髓损伤的机制；充分的临床试验。脊髓损伤发生后其病理生理过程会出现缺血坏死、细胞凋亡、炎性反应，最后导致脊髓空洞或者囊肿形成，因此针对其病理生理特点，牙髓干细胞联合神经生长因子或者相关的细胞因子治疗脊髓损伤可能会取得更加明显的效果。

[1] Willerth SM,Sakiyama-Elbert SE.Cell therapy for spinal cord regeneration[J].Adv Drug Deliv Rev,2008,60(2):263-276.

[2] Lindvall O,Kokaia Z.Stem cells in human neurodegenerative disorders—time for clinical translation?[J].J Clin Invest,2010,120(1):29-40.

[3] Hofstetter CP,Schwarz EJ,Hess D,etal.Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(4):2199-2204.

[4] Erceg S,Ronaghi M,Oria M,etal.Transplanted oligodendrocytes and motoneuron progenitors generated from human embryonic stem cells promote locomotor recovery after spinal cord transection[J].Stem Cells,2010,28(9):1541-1549.

[5] Park SI,Lim JY,Jeong CH,etal.Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell therapy promotes functional recovery of contused rat spinal cord through enhancement of endogenous cell proliferation and oligogenesis[J].J Biomed Biotechnol,2012,2012:362473.

[6] Cummings BJ,Uchida N,Tamaki SJ,etal.Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(39):14069-14074.

[7] Cízková D,Rosocha J,Vanicky I,etal.Transplants of human mesenchymal stem cells improve functional recovery after spinal cord injury in the rat[J].Cell Mol Neurobiol,2006,26(7/8):1167-1180.

[8] Weissman IL.Stem cells:units of development,units of regeneration,and units in evolution[J].Cell,2000,100(1):157-168.

[9] Wagers AJ,Weissman IL.Plasticity of adult stem cells[J].Cell,2004,116(5):639-648.

[10] Gronthos S,Mankani M,Brahim J,etal.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and in vivo[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(25):13625-13630.

[11] Miura M,Gronthos S,Zhao M,etal.SHED:stem cells from human exfoliated deciduous teeth[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(10):5807-5812.

[12] Sonoyama W,Liu Y,Yamaza T,etal.Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth:a pilot study[J].J Endod,2008,34(2):166-171.

[13] Seo BM,Miura M,Gronthos S,etal.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament[J].Lancet,2004,364(9429):149-155.

[14] Morsczeck C,Götz W,Schierholz J,etal.Isolation of precursor cells(PCs) from human dental follicle of wisdom teeth[J].Matrix Biol,2005,24(2):155-165.

[15] Sakai K,Yamamoto A,Matsubara K,etal.Human dental pulp-derived stem cells promote locomotor recovery after complete transection of the rat spinal cord by multiple neuro-regenerative mechanisms[J].J Clin Invest,2012,122(1):80-90.

[16] Suchanek J,Soukup T,Visek B,etal.Dental pulp stem cells and their characterization[J].Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub,2009,153(1):31-35.

[17] Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,etal.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy,2006,8(4):315-317.

[18] Huang AH,Snyder BR,Cheng PH,etal.Putative dental pulp-derived stem/stromal cells promote proliferation and differentiation of endogenous neural cells in the hippocampus of mice[J].Stem Cells,2008,26(10):2654-2663.

[19] Zainal Ariffin SH,Kermani S,Megat Abdul WR,etal.In vitro chondrogenesis transformation study of mouse dental pulp stem cells[J].ScientificWorldJournal,2012,2012:827149.

[20] Yamaza T,Kentaro A,Chen C,etal.Immunomodulatory properties of stem cells from human exfoliated deciduous teeth[J].Stem Cell Res Ther,2010,1(1):5.

[21] Yalvac ME,Rizvanov AA,Kilic E,etal.Potential role of dental stem cells in the cellular therapy of cerebral ischemia[J].Curr Pharm Des,2009,15(33):3908-3916.

[22] Nosrat IV,Smith CA,Mullally P,etal.Dental pulp cells provide neurotrophic support for dopaminergic neurons and differentiate into neurons in vitro;implications for tissue engineering and repair in the nervous system[J].Eur J Neurosci,2004,19(9):2388-2398.

[23] Arthur A,Rychkov G,Shi S,etal.Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues[J].Stem Cells,2008,26(7):1787-1795.

[24] Nourbakhsh N,Soleimani M,Taghipour Z,etal.Induced in vitro differentiation of neural-like cells from human exfoliated deciduous teeth-derived stem cells[J].Int J Dev Biol,2011,55(2):189-195.

[25] Hurlbert RJ.Strategies of medical intervention in the management of acute spinal cord injury[J].Spine(Phila Pa 1976),2006,31(11 Suppl):S16-S21.

[26] Nosrat IV,Widenfalk J,Olson L,etal.Dental pulp cells produce neurotrophic factors,interact with trigeminal neurons in vitro,and rescue motoneurons after spinal cord injury[J].Dev Biol,2001,238(1):120-132.

[27] de Mendonca Costa A,Bueno DF,Martins MT,etal.Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells[J].J Craniofac Surg,2008,19(1):204-210.

[28] Cordeiro MM,Dong Z,Kaneko T,etal.Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth[J].J Endod,2008,34(8):962-969.

[29] Taghipour Z,Karbalaie K,Kiani A,etal.Transplantation of undifferentiated and induced human exfoliated deciduous teeth-derived stem cells promote functional recovery of rat spinal cord contusion injury model[J].Stem Cells Dev,2012,21(10):1794-1802.

[30] Zhang W,Walboomers XF,Shi S,etal.Multilineage differentiation potential of stem cells derived from human dental pulp after cryopreservation[J].Tissue Eng,2006,12(10):2813-2823.

[31] Arora V,Arora P,Munshi AK.Banking stem cells from human exfoliated deciduous teeth(SHED):saving for the future[J].J Clin Pediatr Dent,2009,33(4):289-294.

[32] Ackery A,Tator C,Krassioukov A.A global perspective on spinal cord injury epidemiology[J].J Neurotrauma,2004,21(10):1355-1370.

[33] National Spinal Cord Injury Statistical Center(NSCISC).Spinal Cord Indury Facts[EB/OL].[2009-06].http://www.fscip.org/facts.htm

[34] Noonan VK,Fingas M,Farry A,etal.Incidence and prevalence of spinal cord injury in Canada:a national perspective[J].Neuroepidemiology,2012,38(4):219-226.