表观遗传学在前列腺癌靶向治疗中的研究进展

马宝杰(综述), 牛远杰(审校)

(天津医科大学第二医院泌尿外科 天津市泌尿外科研究所，天津 300211)

肿瘤中遗传信息的改变，一般包括基因的变化和表观遗传学的改变，并且这些改变都是可遗传的。表观遗传学包括DNA甲基化，组蛋白乙酰化，蛋白的磷酸化、泛素化以及核小体重构和非编码RNA相关的调控等。基因的变化通常是不可逆的，然而，表观遗传学的改变不会改变DNA代码，并且是可逆的改变。因此，使用多种手段将肿瘤表观遗传学中的改变逆向转变，是一种治疗的可能性。

前列腺癌是欧美发病率最高的肿瘤，我国前列腺癌发病率也呈明显上升趋势；虽然目前的医学研究进展能治疗局限性的前列腺癌，但对于激素抵抗性或者晚期前列腺癌还缺乏有效的治疗手段，因此进一步研究其发病机制尤其是表观遗传学非常必要[1]。以药物开发为目标的前列腺癌细胞表观基因所取得的进展，尤其强调在该领域的新方向进行如下综述。

1 在前列腺癌中的表观遗传学改变

1.1概述 表观遗传参与了前列腺癌发生、发展及转移等的各个阶段，其中DNA甲基化和组蛋白修饰在前列腺癌机制中的作用尤为重要[1-2]：DNA异常甲基化和前列腺癌DNA损伤修复、激素应答、侵袭和转移密切相关；而组蛋白修饰异常则引起相应染色体结构和基因转录调控的改变。目前已有针对前列腺癌DNA甲基化转移酶和组蛋白去乙酰化酶的抑制剂，经临床验证疗效尚佳，这也提示针对前列腺癌表观遗传学变化的治疗有着广泛的应用前景[1]。

1.2前列腺癌中的DNA甲基化改变 DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶 (DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程，在哺乳动物中其主要发生在5′-CpG-3′的C上生成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化能沉默相关基因的表达，而去甲基化则能诱导相关基因的激活。有研究报道，在前列腺癌中存在多种形式的甲基化水平的改变；其中，较常见的真核基因生化改变是CpG二核苷酸胞嘧啶残基的甲基化，而1%左右的人类DNA中含有的短CpG序列称为CpG岛[1-2]。CpG二核苷酸的胞嘧啶残基甲基化是真核DNA的共同生化修改：成人基因组中60%～90%的CpG二核苷酸发生甲基化，引起自发脱氨基作用，从而导致5′-甲基胞嘧啶转变为胸腺嘧啶[2-4]。在过去，CpG二核苷酸被认为是DMT的初始靶点；但是，2009年出版的人类第一个完整的“DNA甲基化图”挑战了这一观点；并且，在胚胎干细胞中发生高甲基化的位点并非是含CpG的胞嘧啶[1-4]。大多数CpG的甲基化发生在基因内和基因间的非编码区域，这些区域被认为能促进细胞上游分子调节其下游分子；而启动子相关CpG岛通常不会发生甲基化，但显性基因除外[1-4]。启动子的甲基化能直接和间接地抑制转录起始，这种作用是通过结合组蛋白去乙酰酶抑制剂和染色质重构相关因子，带来凝结的染色质结构干扰启动子转录酶的正常作用，从而吸引CpG 甲基化位点区域的蛋白质来实现的[1]。另外，核小体定位可能也对甲基化产生较大的影响[1]。

目前的许多研究已充分认识到，前列腺癌中启动子高甲基化的作用非常重要[2-4]。因为这种修改能沉默许多经典的肿瘤抑制基因，包括腺瘤性结肠息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)基因和Ras相关区域家族1(Ras-association domain family 1,RASSF1)，以及雄激素和雌激素受体基因，细胞黏附基因(CD44和CDH1)，细胞周期控制基因(CCND、CDKN1B和SFN)和凋亡基因(PYCARD、RPRM和GLIPR1)等[1-4]。在这些基因中，尤其是GSTP1基因，已经有非常明确的证据证实其启动子区的甲基化导致其基因表达的沉默，这种现象在90%以上的前列腺癌和75%以上的侵袭前高级别的前列腺上皮内瘤变中均广泛存在，甚至在一定程度上被作为诊断前列腺癌的分子标记[1-4]。

高甲基化发生在早期前列腺癌，但更广泛地发生在转移性前列腺癌上[1-4]。基因组的甲基化改变与肿瘤分级、Gleason评分≥7以及诸如基因GSTP1、RARB、APC、PYCARD、PTGS2、ABCB1和RASSF1启动子区的甲基化水平密切相关。

DMT在DNA甲基化过程中起着非常关键的作用，并且在甲基化遗传过程中也发挥重要作用[1]。DMT主要包括3类，分别是DMT1、DMT2、DMT3A和DMT3B：其中DMT1主要起维持DNA甲基化的作用，这种作用是DMT1通过增加S期的细胞周期增殖细胞核抗原和E3泛素化蛋白连接酶(一种关键的有丝分裂遗传基因组甲基化模式的组蛋白结合酶)来实现的；DNA复制后，DNMT1 通过甲基化新的DNA合成链，从而将这种甲基化遗传下去；DMT2与DNA特异位点结合的作用和机制目前还不清楚；DMT3a和DMT3b能使去甲基化的CpG位点重新甲基化，即参与DNA的从头甲基化[1]。有证据表明，DMT3B和DMT1在肿瘤细胞中的联合作用能起到维持DNA甲基化和相关基因沉默的作用[1]。DMT也可通过招募组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)和其他染色质相关的组蛋白到启动子区域来抑制转录，这种作用是依赖于甲基转移酶的活性的。DMT和HDAC结构上的相关性可能产生了一种维持基因沉默的辅助作用：促进HDAC绑定复制叉(其作用是确保在每一次的细胞分裂中新组装的核小体包含低乙酰化的组蛋白)。因为DMT是优先作用于细胞核内的DNA，所以细胞核内DNA比核外DNA甲基化程度要高[5]。此外，有研究报道，核小体DNA有更高度的DNA甲基化[2-4]。

1.3前列腺癌中的组蛋白乙酰化改变 组蛋白是指能结合下游DNA的蛋白，其在信号通路和机制研究中的作用举足轻重。组蛋白能调控和其结合的DNA的表达和其甲基化等的改变，组蛋白的N端尾巴伸出核小体之外，由于其富含正电荷氨基酸故受到各种可逆的转录后修饰。这些修饰包括乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化、poly-ADP核糖基化、类泛素化、羰基化和糖基化，但其中许多修饰的方式在肿瘤发展中的作用还不得而知。组蛋白乙酰化和前列腺癌的关系密切，目前研究多报道在前列腺癌中组蛋白乙酰化水平升高[1，6]：其修饰的异常可引起相应染色体结构和基因转录调控的改变，影响细胞分化和凋亡，导致前列腺癌的发生。

在雄激素受体的调控中乙酰化很常见，雄激素受体通过影响相关乙酰化酶来激活或者抑制其下游相关基因，其中被激活的因子包括KAT2B、KAT5、NCOA1和EP300等[1]。并且，HDAC1、HDAC2、HDAC3和siRT1能下调雄激素受体的表达；但与此矛盾的是，在50%～70%的前列腺癌中HDAC1和HDAC3却能激活一半以上的雄激素受体的下游基因，包括TMPRSS2[1]。

前列腺癌进展也一直与组蛋白调节酶的过度表达相关，其中的许多种是前列腺癌独立的预后指标。赖氨酸特异性脱甲基酶1A(lysine-specific demethylase 1A,KDM1A)是第一个被发现的组蛋白赖氨酸脱甲基酶。KDM1A与雄激素受体相互作用，通过转录组蛋白H3 lys9m1和H3 lys9m2促进激素依赖的其下游目标基因的转录。在前列腺癌中，高水平的KDM1A与患者的复发风险的增加呈正相关。KDM4C被确定为第一个调节雄激素受体功能的组蛋白赖氨酸脱甲基酶。KDM4C与KDM1A在前列腺中能通过H3 lys9m的脱甲基，从而协同刺激雄激素受体依赖的基因转录[1-2,6]。

多梳组蛋白能长期维持发育调节基因的转录沉默，这个小组的成员之一组蛋白赖氨酸脱甲基酶果蝇zeste 基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)，是参与细胞记忆、X染色体失活、胚系发展和干细胞多能性的一种转录抑制因子。EZH2通过H1lys26、H3lys9和H3lys27影响其下游基因的甲基化[7-8]。EZH2在前列腺癌中表达，并和其转移密切相关；EZH2的水平在去势抵抗性前列腺癌患者中也升高[9]。

1.4前列腺癌中的非编码RNA改变 非编码RNA这些分子被认为间接参与了通过转录后关键表观酶的失活，长链的非编码RNA形成了组蛋白变化的骨架，非编码RNA中的小分子RNA已成为前列腺癌细胞中DNA甲基化的一个靶点[6,10-11]。与之相关的一些畸变促进基因组不稳定性，并导致肿瘤抑制基因沉默和致癌反转录病毒激活[6,10-11]。非编码RNA在前列腺癌中的作用是很关键的，如其中的HoX反义基因间RNA可作为支架，使绑定特定的酶复合物(PRC2和KDM1A)到它们的目标基因。另外，miR-101能直接参与EZH2的表达，在大约1/3的前列腺癌中miR-101的表达缺失，导致EZH2表达的增加[12]。

由此可见，在前列腺癌中存在多种形式的非常重要的表观遗传学改变，因此针对前列腺癌的治疗也包括针对这些表观遗传学改变的治疗。

2 表观遗传学的相关基因和针对的靶向治疗

2.1组蛋白去乙酰化酶抑制剂 组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，而不会产生严重的不利影响。组蛋白去乙酰化酶抑制剂有很多种，根据其化学结构和疗效的不同可分为7类：短链脂肪酸、氧肟酸化合物、环四肽、苯甲酰胺类、三氟甲基酮、氧肟酸苯衍生物栓和其他化合物[13-18]。这些HDAC抑制剂诱导前列腺癌细胞凋亡的作用不同，每种抑制剂针对不同的细胞系起作用：① 短链脂肪酸的HDAC抑制剂类，包括酸丁酸和丙戊酸，其中酸丁酸在体外需要毫摩尔的量才能达到抑制效果，这可能限制其在临床的应用；丙戊酸抑制前列腺癌生长的作用在裸鼠身上经过验证，本剂具有包括多种效果，阻滞细胞周期，增加细胞凋亡，减少肿瘤血管生成和诱导肿瘤细胞衰老的作用[13-18]。②异羟肟酸化合物，包括曲古菌素A(从吸水链霉菌中分离得到)以及人工合成化合物伏立诺他和帕比司他，这类化合物较短链脂肪酸剂的疗效更好：通过结合酶的催化部位，仅需要微摩尔或者纳摩尔的量即可在体内外起作用；曲古抑菌素A和伏立诺他通过抑制前列腺癌细胞的生长，都引起细胞死亡，抑制雄激素受体(androgen receptor,AR)的表达；伏立诺他还能抑制CWR22细胞系的动物模型中前列腺癌的生长[13-18]。③高度有效的HDAC抑制剂环四肽类包括罗咪酯肽、Trapoxin A和组蛋白脱乙酰酶抑制剂Apicidin。其中罗咪酯肽能诱导NIH 3T3细胞形态转化逆转，仅需要纳摩尔的量就能抑制在G1和G2/M期细胞周期的过渡，也能抑制动物实体肿瘤的生长[13-18]。④还有多样化的合成剂，如恩替诺特和Tacedinaline，在微摩尔的量时起效：恩替诺特捕获人前列腺癌细胞(PC-3)和LNCaP，诱导细胞DU145细胞死亡，抑制体内的这三种肿瘤细胞株皮下移植瘤的生长，其中前列腺癌转基因小鼠(transgenic adenocarcinoma of the mouse prostate，TRAMP)模型帮助证实了其对前列腺癌的治疗作用[1,13]。⑤羟-栓通过B细胞淋巴瘤和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶导致细胞凋亡，并对PC-3鼠模型起作用[1,13-18]。⑥最后两类HDAC抑制剂类包括电酮、三氟甲基酮和杂化合物Depudecin和Mocetinostat，目前还没有公布相关的证据[1]。

2.2HDAC抑制剂的作用方式 几乎所有的HDAC抑制剂导致在G1～S交界处的细胞分化和细胞周期阻滞，并且HDAC抑制剂通过调节宿主免疫反应和肿瘤血管的形成，影响肿瘤的生长[13-18]。而某些类别的HDAC抑制剂通过改变直接参与血管生成的表达基因，如血管内皮生长因子和乏氧诱导因子1a起到抑制作用。血管生成抑制剂可以限制原发肿瘤的养分供应，也能抑制阻止肿瘤细胞进入血液循环转移扩散；HDAC抑制剂可通过上调增加的主要组织相容性复合类和二类蛋白表达的肿瘤细胞的免疫原性，并共同刺激或黏附分子；这些变化使癌细胞更容易受到免疫系统的破坏，也可以通过调节改变增强免疫细胞活性的细胞因子产生抗肿瘤免疫[1,13-18]。

然而，HDAC抑制剂伏立诺他和帕比司他也阻止了AR基因转录抑制雄激素受体介导的转录激活，通过与RNA聚合酶Ⅱ的复杂的装配干涉雄激素受体在靶基因启动子的表达[13-18]。

2.3核苷DMT抑制剂 在DNA合成中，经过药物治疗后，甲基转移酶活性缺乏会导致纳入基因组甲基化的胞嘧啶减少。应用于动物实验和临床试验的药物有：5-氮胞苷、地西他滨、二氢-5-胞苷、法扎拉滨和Zebularine，其中前两个最好，都被广泛应用于细胞培养模型，通过对抗DNA的甲基化和恢复沉默的基因表达起作用；在临床研究中经证实，这两种药物在治疗血液系统恶性肿瘤有巨大的潜力，并且5-氮胞苷已经获得美国食品药品管理局的批准用于骨髓增生异常综合征的治疗，对于前列腺癌也有巨大的潜力[1,19]。

但是，这5种药物对于实体肿瘤的治疗有其局限性：5-氮胞苷和地西他滨有很强的细胞毒作用，还有致突变和肿瘤的不良反应等，并且它们高度不稳定，以及由于能被水解裂解和脱氨胞嘧啶脱氨酶降解导致半衰期短；Zebularine在水溶液中稳定，在动物实验中毒性最小的抑制胞苷的脱氨酶。因此，几种药物联合应用可能效果较好[1,19]。

2.4非核苷类抑制剂 由于核苷转移酶抑制剂有较大的毒性反应，无需事先掺入到DNA而直接作用于这些酶的化合物治疗成为了重点[1]：如局部麻醉剂普鲁卡因和普鲁卡因胺及其衍生物。已被证明，在LNCaP的体内外模型中，普鲁卡因胺抑制GSTP1甲基化和恢复GSTP1的表达[1]。普鲁卡因胺被认为是直接抑制DNMT1结合的DNA丰富的CpG序列，抑制酶和CpG的结合[1]。其他方法包括利用反义RNA或小分子干扰核糖核酸降解DMT的信使RNA：RG108，一种人工合成设计的分子，直接抑制DMT，从而有效地在体外阻止这些酶并无毒性作用[1]。所有上述与前列腺癌患者的新型药剂的作用仍有待探索。然而，一些研究表明，非核苷转移酶抑制剂不见得比核苷DMT抑制剂类药物毒性作用小；此外，非核苷类药物的疗效也比较差[1]。

3 化学预防

越来越多的证据表明，肿瘤在发展成侵袭性以前会有一些表观遗传学异常；在前列腺癌的早期阶段几乎是普遍的GSTP1灭活，这意味着抑制GSTP1的甲基化可能是一种防止恶化成前列腺癌的有效方法[1,20-21]。此外，由于许多不同基因启动子的甲基化发生在前列腺癌的早期阶段，表观基因可能是一个潜在的化学预防目标[1]。启动子甲基化是最早的分子异常之一，在整个疾病进展中持续存在，并且广泛低甲基化在疾病转移时更加明显[1,20-21]。启动子超甲基化和原癌基因激活是一个尚待探索的现象，对此发生的时间和程度尚不清楚[1,20-21]。

4 膳食成分的影响

天然存在膳食中的一些有治疗作用的成分：绿茶中的没食子儿茶素-3-没食子酸、重多酚；大豆中的染料木素、大豆主异黄酮；异硫氰酸酯，如十字花科蔬菜中的苯乙酯异硫氰酸酯[1]。在前列腺癌细胞系中，微摩尔量的这些化合物就能抑制DMT和HDAC的活性，复苏抑癌基因的活性等治疗作用[1]。苯乙基异硫氰酸酯诱导通过蛋白激酶B和核因子κΒ信号通路抑制前列腺癌细胞株及移植瘤的生长。姜黄素有许多药用价值和抗癌特性，此化合物会导致p53产生和组蛋白H3和H4一样的磷酸化和乙酰化：姜黄素与异硫氰酸苯乙酯结合，可大大降低PC-3小鼠移植瘤的生长，已经有报道证明有此种饮食习惯的人们发病率低，虽然这些饮食中的成分所起作用的大小还不明确，但长期坚持此类饮食确实有保护作用，这为以后的相关药物开发提供了新的方向[1]。

5 综合治疗

由于组蛋白去乙酰化酶抑制剂疗效好，毒性反应最少，可以联合他和其他类药物：如对于DU145、胞苷和曲古菌素A联合治疗优于单独治疗；还有应用HDAC抑制剂罗咪酯肽、伏立诺他、丁酸钠和曲古菌素A中的任意一种，联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，对于前列腺癌细胞系，可以增强对肿瘤的细胞毒作用，并协同增加其凋亡；另有文献报道，组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合传统的化疗药物(多西他赛)或雄激素抑制剂(比卡鲁胺)，对于前列腺癌细胞也有较好的抑制作用[22-24]。

DNMT联合化疗药物或雄激素抑制剂：应用地西他滨和紫杉醇或顺铂联合治疗有协同作用，对前列腺癌细胞生长的促进凋亡诱导和细胞周期停滞，在G2/M期过渡阶段期的抑制作用；而对TRAMP鼠，联合地西他滨和去势治疗优于单一治疗[22-24]。

6 问题与展望

目前，表观遗传学作为研究的热点，越来越受到广泛的关注，针对其进行的药物治疗也在不断地探索和完善。虽然目前已经有了很多成熟的药物在临床应用，但是它们的作用机制需要进一步探讨研究，并且一些甲基化改变在治疗后仍能持续存在从而影响疗效。一些药物，如地西他宾和氮胞苷的不良反应和毒性也限制了其在临床的应用；而一些毒性作用小的非核苷转移酶抑制剂的药物，疗效则非常有限，难以在临床应用[1，25]。

目前对前列腺癌的治疗，表观遗传学上有了一些进展[1，25]。由于前列腺癌的进展相对缓慢，疾病周期较为漫长。行前列腺癌根治术后，前列腺特异抗原和肿瘤生长等得到了较好的控制，疾病预后的生存时间长，为不同的治疗提供了机会和观察的时间[1-2，25]。当前，针对雄激素受体信号系统的新药开发和联合治疗有很大潜力，而在表观遗传学上的探索对其的治疗也开辟了崭新的方向[1，25]。相信随着研究的深入，相关的药物会有更加广阔的应用前景。

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