鱼精蛋白截短体在构建融合蛋白中应用的研究进展

邵 远，姚 璐(综述)，张有成(审校)

(兰州大学第二附属医院普通外科，兰州 730030)

鱼精蛋白最初发现于鱼类(如蛙鱼、鳟鱼、鲱鱼等)成熟精子细胞,它能将基因DNA集中在精子头部,促进遗传信息的传递，其是富含阳离子的强碱性蛋白，而且结合DNA的能力强[1-3]。鱼精蛋白截短体(truncated protamine，tP)作为鱼精蛋白的衍生物，已经被很多研究者用于构建融合蛋白。该文就tP在构建融合蛋白中的应用及探索研究予以阐述。

1 tP的结构及功能

tP是一段长度为15个氨基酸的短肽，保留了富含碱性氨基酸的序列，不仅具有DNA结合活性，而且具有较小分子量，组织穿透能力强等特点[4]。tP既可以用作DNA的载体，用于构建tP/DNA复合物，也可用于合成融合蛋白。

2 融合蛋白及特点

融合蛋白是将目的基因与靶基因重组形成融合基因，融合基因是在原核生物中表达后的产物。融合蛋白在临床应用广泛，如DNA疫苗、双功能酶(多功能酶)、定向药物、载体，尤其在肿瘤研究方面已经取得了一定的成就[5]。然而，一般合成的融合蛋白存在很多不足，最大的缺点是不稳定，易发生降解，而且融合蛋白在体外真核蛋白不易正确折叠，这些缺点都限制了其广泛的临床应用[6]。

3 tP合成的融合蛋白的临床前研究

目前临床中很多研究者已经利用tP成功构建融合基因，融合基因所表达的融合蛋白克服了普通融合蛋白的不稳定性以及不易正确折叠的缺点，为融合蛋白在病毒感染和肿瘤的靶向治疗以及其他疾病的治疗方面奠定一定的理论基础。

3.1病毒感染方面的研究 单链抗体(single chain variable fragment，ScFv)具有分子小、穿透力强、免疫原性低等特点,已成为诊断和治疗的良好导向载体[7-8]。Zhang等[9-10]成功获得ScFv/tP融合基因，并表达为ScFv/tP融合蛋白。此融合蛋白可以作为PA492基因的载体，将PA492导入犬肾传代细胞，并可以有效地控制犬肾传代细胞中的禽流感病毒，而且ScFv/tP融合蛋白作为载体比脂质体效果更好。ScFv/tP融合蛋白可以作为禽流感病毒特异小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的载体，并用于禽流感病毒感染的基因治疗，因此ScFv/tP融合蛋白可以为病毒的治疗提供一种新的思路。还有学者将人抗HBsAg ScFv/tP融合基因在大肠埃希菌中表达，纯化获得ScFv/tP融合蛋白，分析其蛋白活性可知其同时具有HBsAg和DNA结合活性，为ScFv/tP融合蛋白作为载体研究乙型肝炎的治疗奠定了理论基础[11]。

3.2肿瘤靶向治疗方面的研究 原癌基因人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)是癌基因erbB2/neu的表达产物,在多种人类肿瘤细胞中高度表达,尤其是乳腺癌，是公认的肿瘤细胞表面的特异性标志分子[12-13]。Kappa light chain constant region(Ck)，即DNA编码区的轻链恒定区。王凯等[14]成功构建了人抗HER2 ScFv/Ck/tP融合基因，将融合基因克隆入原核表达载体pET32a后，在大肠埃希菌BL21(DE3)LysS中诱导表达，表达的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析及Western blot鉴定表达，再用Ni-NTA(镍离子亲合层析柱)螯合层析介质纯化。表达的ScFv/Ck/tP融合蛋白同时具有抗原和DNA结合活性,为ScFv靶向输送DNA或siRNA用于HER2阳性肿瘤的靶向基因治疗提供了依据。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员，是目前发现最强的凋亡抑制因子，具有抑制细胞凋亡，促进细胞转化并且参与细胞的有丝分裂、血管的生成和肿瘤细胞耐药性的产生等作用[15]。蔡磊[16]构建ScFv/tP融合基因，融合基因在大肠埃希菌中诱导表达，利用HisTrap Ni-NTA螯合层析介质纯化所得蛋白。研究发现ScFv/tP融合蛋白可特异性地被肝癌细胞通过内吞作用摄入细胞内；ScFv/tP融合蛋白同时具有DNA结合活性。ScFv/tP融合蛋白介导的特异的siRNA能够靶向诱导肝癌细胞凋亡，理论上ScFv/tP融合蛋白可以作为肝癌靶向治疗载体，为肝癌的治疗提供了新的方法[16]。上皮细胞黏附分子是一种由GA-733-2基因编码的相对分子质量为40×103的跨膜糖蛋白，作为嗜同种的钙非依赖性的上皮细胞间黏附分子在上皮癌变过程中发挥作用。Hao等[17]构建了上皮细胞黏附分子单链片段可变区抗体与tP以及siRNA的融合蛋白，此蛋白具有通过结肠癌细胞识别并结合上皮细胞黏附分子的抗原活性，而且转入结肠癌细胞的特异siRNA特异性抑制Wnt信号/β联蛋白的信号传输，因此EpCAM scFv/tP-siRNA融合蛋白可能为结肠癌的治疗提供新方案。表皮生长因子受体属Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体，是原癌基因C-erbB-1的表达产物，在人体多种实体肿瘤(如结直肠癌、头颈部肿瘤、食管癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤等)中均有高度表达，与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移、血管生长及细胞凋亡的抑制有密切关系。有学者成功构建了人表皮生长因子受体抗体/tP融合基因,由此融合基因成功表达了ScFv/tP融合蛋白，并通过验证此融合蛋白具有与表皮生长因子受体抗原和DNA结合的活性，因而ScFv/tP融合蛋白为表皮生长因子受体表达阳性肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础[18]。潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP1)是由EB病毒编码的一种蛋白，其与人类多种肿瘤的发生、发展密切相关，LMP1蛋白具有诱导细胞增殖迁移、抑制细胞终末期分化和凋亡等多种信号传递和调控功能[19]。黄秀兰等[20]成功获得了LMP1/scFv/tP融合基因，获得的融合基因片段克隆至原核表达载体pET32a，并在大肠埃希菌中诱导表达融合蛋白，经聚丙烯酰氨凝胶电泳和Western Blot验证其为LMP1/scFv/tP融合蛋白。LMP1/scFv/tP融合蛋白除了具有特异性结合LMP1的活性外，还为该融合蛋白用于LMP1相关肿瘤的基因治疗提供了理论依据。

3.3其他疾病的探索研究 癌钙调蛋白是一种钙结合蛋白，在机体具有促进轴突再生的作用,并且在中枢神经系统和外周神经系统的作用类似。石燕红等[21]在原核表达载体中成功构建癌钙调蛋白/tP融合基因。在大肠埃希菌诱导表达癌钙调蛋白/tP融合蛋白，然后通过聚丙烯酰氨凝胶电泳分析及Western blot鉴定表达的蛋白。此融合蛋白理论上可将癌钙调蛋白的促进轴突再生的作用与拮抗抑制视神经再生的作用结合起来，用于治疗视神经的损伤，为视神经的损伤后的再生性研究提供了新的思路。

3.4相关的探索研究 有学者将抗HIV-1 envelope Fab抗体与鱼精蛋白融合重组，成功地与细胞表面受体相结合，通过细胞内吞作用将gag siRNA传递入HIV+的T淋巴细胞并有效地阻止了复制；将抗erbB2 ScFv与鱼精蛋白融合重组后成功地将c-myc基因、MDM2(鼠双微体)基因、血管内皮生长因子基因的特异性siRNA导入B16黑色素瘤细胞内，并对肿瘤细胞的增殖产生了影响[22]。

4 小 结

tP构建的融合蛋白的方法：研究者设计引物扩增目的基因，然后在其3′端引入tP的编码基因,经聚合酶链反应扩增获得目的/tP融合基因。再根据融合基因选择相应的载体，根据表达载体的限制性酶切位点，在融合蛋白基因的5′和3′末端分别设计两种酶切位点，采用聚合酶链反应为基础的基因拼接获得目的基因/tP融合基因。将融合基因亚克隆至另一个克隆载体中，经过酶切鉴定和测序验证；进一步将序列完全正确的融合蛋白基因克隆至原核表达的载体。最后在大肠埃希菌中诱导表达目的基因/tP的融合蛋白。再通过聚丙烯酰氨凝胶电泳分析及Western blot鉴定表达的融合蛋白，融合蛋白不仅保持了与抗原的结合活性，而且具有抗原与DNA结合的能力。此方法已经被多位研究者应用于实验研究，但目前仍处于临床前研究阶段，因此很多临床研究及探索研究都是很有必要的。

tP构建的融合蛋白已经应用于病毒和肿瘤的临床前研究，而且tP在构建融合蛋白中起重要作用，为融合蛋白广泛的临床研究及临床应用提供了可能。今后的研究中，通过探索一些病毒和肿瘤特异的抑制或治疗基因，并将其与tP基因融合，然后在原核生物中表达出融合蛋白，探索该融合蛋白对病毒或肿瘤的治疗作用，可以为病毒或肿瘤治疗提供新思路以及研发新药物。

[1] Poplonska K,Wojtczak A,Kwiatkowska M,etal.Cytochemical and immunocytochemical studies of the localization of histones and protamine-type proteins in spermatids of Chara vulgaris and Chara tomentosa[J].Folia Histochem Cytobiol,2007,45(4):367-374.

[2] Ortner A,Wernig K,Kaisler R,etal.VPAC receptor mediated tumor cell targeting by protamine based nanoparticles[J].J Drug Target,2010,18(6):457-467.

[3] Awe S,Renkawitz-Pohl R.Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone-to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster[J].Syst Biol Reprod Med,2010,56(1):44-61.

[4] Wen WH,Liu JY,Qin WJ,etal.Targeted inhibition of HBV gene expression by single-chain antibody mediated small interfering RNA delivery[J].Hepatology,2007,46(1):84-94.

[5] 马海智.融合蛋白在肿瘤研究中的应用[J].肿瘤防治研究,2007,34(5):383-386.

[6] 李立家,肖庚富.基因工程[M].北京:北京科学技术出版社，2004：53-61.

[7] Aires da SilVa F，Costa MJ，Corte-Real S，etal.Cell type-specific targeting with sindbis pseudotyped lentiviral vectors displaying anti-CCR5 single-chain antibodies[J].Hum Gene Ther，2005,16(2):223-234.

[8] Suzuki M，Takayanagi A，Shimizu N.Targeted gene delivery using humanized single-chain antibody with negatively charged oligo peptide tail[J].Cancer Sci，2004,95(5):424-429.

[9] Zhang T,Wang CY,Zhang W,etal.Generation and characterization of a fusion protein of single-chain fragment variable antibody against hemagglutinin antigen of avian influenza virus and truncated protamine[J].Vaccine，2010,28(23):3949-3955.

[10] Zhang T,Zhao PS,Zhang W,etal.Antisense oligonucleotide inhibits avian influenza virus H5N1 replication by single chain antibody delivery system[J].Vaccine，2011,29(8):1558-1564.

[11] 孟艳玲,温伟红,薛茜，等.人抗HBsAg单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白基因的构建、表达及活性鉴定[J].第四军医大学学报，2006,27(15):1349-1352.

[12] Kumar R,Yarmand-Bagheri R.The role of HER2 in angiogenesis[J].Semin Oncol，2001,28(5 Suppl 16):27-32.

[13] Baxevanis CN，Sotiropoulou PA，Sotiriadou NN，etal.Immunobiology of HER-2/neu oncoprotein and its potential application in cancer immunotherapy[J].Cancer Immunol Immunother，2004,53(3):166-175.

[14] 王凯,温伟红,王涛，等.人源抗HER2单链抗体/轻链恒定区/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建、表达及活性鉴定[J].第四军医大学学报,2007,28(7):581-584.

[15] Guha M,Xia F,Raskett CM,etal.Caspase 2-mediated tumor suppression involves survivin gene silencing[J].Oncogene，2010,29(9):1280-1292.

[16] 蔡磊.携带Survivin 特异性siRNA 的完全人源性肝癌单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白对肝癌凋亡的影响研究[D].西安：第四军医大学，2010.

[17] Hao H,Zhen Y,Wang Z,etal.A novel therapeutic drug for colon cancer:EpCAM scFv-truncated protamine (tp)-siRNA[J].Cell Biol Int,2013,37(8):860-864.

[18] 张峰,王小英,唐奇,等.人源抗EGFR抗体-鱼精蛋白融合蛋白的制备及活性分析[J].南京医科大学学报：自然科学版,31(5):651-654.

[19] Rmeier U,Hofmann R,Kilger E,etal.Latent membrane protein 1 of Epstein-Barr virus coordinately regulates proliferation with control of apoptosis[J].Oncogene,2005,24(10):1711-1717.

[20] 黄秀兰,唐旭东,熊亮,等.重组抗LMP1单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建及表达[J].广东医学院学报,2008,26(1):1-4.

[21] 石燕红，薛铮，朱彤,等.癌钙调蛋白/鱼精蛋白截短体融合基因在原核表达载体中的构建及鉴定[J].眼科研究，2010，28(5):401-405.

[22] Song E,Zhu P,Lee SK,etal.Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors[J].Nat Biotechnol,2005,23(6):709-717.