富血小板血浆应用于间充质干细胞体外培养的研究进展

文 军，李 东(综述),段建民※(审校)

(1.广州军区广州总医院口腔科，广州510010； 2.东华医院口腔科，广东 东莞 523220)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种未分化细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我复制以及在一定条件下向骨、软骨、脂肪和肌肉等组织细胞分化的能力。因此，以MSCs为基础的细胞疗法得到广泛的研究，并且在临床上开展应用。在临床应用的准备阶段，MSCs需要在体外进行大量扩增。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)能为细胞的增殖、迁移和分化等生物学行为提供营养、生长因子和激素等生物活性物质，是应用于细胞培养的最常见物质。然而，FBS含有的大量异种蛋白，应用于临床可能引来一系列伦理和免疫风险，美国食品和药品管理局已经严格限制了FBS应用于临床。目前大量的研究在探索用富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)取代FBS用于MSCs的体外扩增[1]。

1 PRP的生物学特性

PRP是自体全血经离心后得到的血小板浓缩物，一般含有大量的血小板和少量的其他血细胞。血小板中含有丰富的生长因子，包括血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)，碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素样生长因子，转化生长因子β和血管内皮生长因子，这些细胞因子在细胞的增殖过程中都发挥着重要作用。PRP还含有人β防御素2，可以有效预防大肠埃希菌、巨大芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌和奇异变形杆菌的感染[2]。

由于个体差异以及不同的制备过程，比如血小板的分离(两次离心法或者血液成分除去法)，血小板的裂解(不同的温度，冻融的次数)，血小板残渣的去除(离心的速度和时间)等，会导致PRP中各细胞成分不同，生长因子的浓度和活性也各不相同[3]。与合成代谢相关的细胞因子PDGF、转化生长因子β的浓度与血小板的浓度呈正相关，与分解代谢相关的细胞因子基质金属蛋白酶9、白细胞介素1β的浓度与中性粒细胞的浓度呈正相关，此外白细胞介素1β的浓度还与单核细胞的浓度呈正相关[4]。

PRP应用前需用一定方法激活，通过血小板的黏附、凝集或者破裂将生长因子从血小板α颗粒中释放出来。与此同时白细胞的破裂还伴有促炎性细胞因子的释放[5]。目前常用凝血酶、氯化钙或者反复冻融的方式对PRP进行激活。Textor等[6]将马血样本制备的PRP分别用自体凝血酶、牛凝血酶、氯化钙和反复冻融等4种方式进行激活，酶联免疫吸附测定PDGF-BB和转化生长因子β1在PRP上清液中的浓度并进行统计学分析。氯化钙激活的PRP中PDGF-BB水平显著高于其他激活方式，而转化生长因子β1在氯化钙、牛凝血酶和反复冻融激活的PRP中释放水平相当。自体凝血酶在激活血小板释放生长因子方面显著不如其他方法，因此不建议使用自体凝血酶作为PRP的激活剂。氯化钙可释放血小板中80%的PDGF，是一种经济、高效的激活剂。考虑到牛凝血酶作为异种蛋白应用于临床同样存在病毒传播、免疫抑制及凝血功能障碍等一系列潜在风险，而氯化钙中的钙离子对科研过程存在干扰，李洪涛等[7]尝试用液氮冻融方法裂解血小板，经过比较发现，液氮冻融激活的洗涤血小板在一定浓度下可以显著促进人牙髓细胞的增殖，而且比牛凝血酶激活的PRP效果更好。由此可见，针对不同的临床应用，应采用不同的PRP制备方法。

迄今为止，国际上仍无公认的PRP制备方法，不同学者应用各自方法制备的PRP作出的实验结论不具备可比性。对PRP进行标准化，使PRP的使用具有可靠性和重复性，保证科研和临床质量，是一项亟需解决的工作。Amable等[8]发现，采用同一标准化流程制备和激活PRP，可避免由于静脉血采集自不同志愿者引起的个体差异，使其中的生长因子含量保持相对一致水平。临床工作中，一般采用将多人份来源的血小板混合，制备成混杂PRP以减少批次间的差异，并由此获取大量的PRP。

2 PRP对干细胞体外增殖的作用

与FBS相比，PRP可以显著促进骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)[9-10]、脂肪间充质干细胞[11-12]、肌肉干细胞[13]、肌腱干细胞[14]等的增殖，增加克隆形成率和纤维母细胞集落形成单位大小，减少达到汇合的时间。

国内多位学者对PRP促进牙髓干细胞增殖的作用进行了研究。赵晟楠等[15]用全自动血液细胞分析机采集人血小板并制备PRP，发现1%～20%PRP具有促进牙髓干细胞生长增殖的效应，其效果近似10%FBS。唐凤勤等[16]应用两步离心法制备PRP，研究结果显示10%PRP促进牙髓细胞增殖作用强于相同浓度的FBS，并且明显好于5%和20%的PRP。同时发现加入PRP后细胞形态发生明显的变化，由原来的长梭形，变为胞体减小、突起增加的极性细胞，将PRP去除后细胞又恢复原来的形态和生长速度。李威等[17]研究了不同浓度的PRP对犬牙髓成纤维细胞的促增殖作用，认为随着PRP浓度的增加，对牙髓成纤维细胞的增殖作用经历下面3个阶段：①细胞的增殖与PRP的浓度呈正比；②PRP达到一定浓度，细胞的增殖反应呈饱和状态，细胞的增殖与PRP的浓度无关；③当PRP的浓度继续升高，细胞的增殖与PRP的浓度呈负相关。即PRP对细胞增殖的作用为低浓度时刺激生长、高浓度时抑制生长的双向反应。段建民等[18]的研究也支持PRP只在一定浓度范围内能够促进牙髓细胞的增殖，他们发现将PRP中的血浆去除后对牙髓细胞增殖的促进作用更强，提示可能血浆成分中存在对抗牙髓细胞增殖的因素。

PRP的促增殖作用与其细胞成分密切相关。PDGF在促进细胞增殖方面可能起了关键的作用，用抗体选择性阻断PDGF后，PRP的促增殖作用被显著抑制[19]。含有白细胞的PRP比不含白细胞的PRP释放碱性成纤维细胞生长因子的速度更快，促进BMSCs增殖的能力更强[20]。脐带血来源的PRP因含有更多的未分化细胞，其促增殖能力比静脉血来源的PRP更强[21]。

PRP的促增殖作用依赖于各种生长因子的协同作用[22]。这些生长因子可以激活血小板源性生长因子受体/磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶/核因子κB信号通路，提高旁分泌水平，促进细胞再生，使细胞耐受不良环境的能力更强，减缓细胞的凋亡[23]。

Pawitan等[24]分析了10篇用PRP替代FBS用于细胞培养的研究，大部分研究认为PRP用于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSCs)和脂肪间充质干细胞培养时优于或至少等效于FBS，对于PRP的最佳有效浓度没有一致的结论，归因于PRP制备方式的不同。

将人的成骨细胞和自体PRP共培养，经流式细胞术检测，成骨细胞的细胞周期没有发生改变，PRP的促进增殖作用随着时间的延长慢慢消失，因而不会引起细胞的无序增殖[25]。Bieback等[26]的研究显示，在BMSCs与PRP共培养的体系中未检测到自发性的细胞转化，在所有代数细胞中未检测到端粒酶活性。PRP促进细胞增殖的作用与细胞的状态有关，对不同年龄段志愿者的BMSCs进行培养发现，老年志愿者来源的细胞增殖能力显著降低[27]。这些研究说明PRP不改变细胞的性状，不会导致细胞恶性变。

3 PRP维持干细胞干性的作用

干细胞的干性，即干细胞保持自我更新和多向分化的能力，有赖于干细胞的不对称分裂。一个母代干细胞通过不对称分裂产生一个子代干细胞和一个祖细胞，祖细胞再分化为终末细胞。干细胞在体外扩增时，一方面细胞群体数量要增加，更为重要的是要保持多向分化的能力。

通过比较血小板裂解物和FBS对马的BMSCs体外培养，发现在两种培养基中细胞的产出率、成纤维细胞集落生成单位、细胞倍增时间等方面无明显差异；此外，两种培养基中的细胞均可检测出干细胞的标记基因Sox2、Oct4和Klf4，证明两种培养基中的细胞均保持了干细胞特性[28]。

利用PRP替代FBS对脂肪干细胞进行体外培养，细胞具有更高的增殖率，且终生保持干细胞特异性表面标志物和多向分化能力[29]。在对肌肉干细胞的研究中发现，PRP在促进细胞增殖和维持多向分化能力的同时，还保持了干细胞特有的免疫抑制性[22]。

但是，PRP培养的MSCs细胞形态较小，大多表现为纺锤形，且多成簇聚集。PRP对干细胞表面的黏附因子可能有一定的影响，Bernardo等[30]的研究发现PRP培养的BMSCs与培养瓶附着较松，在从培养瓶上分离时用胰蛋白酶水解时间较短。但另一针对脂肪干细胞的研究却得出相反的结论，认为PRP培养的脂肪干细胞与塑料培养瓶的附着更紧[31]。

4 结 语

FBS从胎牛体内获取，需要将怀孕的母牛处死，目前的制取方法会导致大量胎牛的死亡；FBS的成分不确定，每一批次间各种成分的含量千差万别，因此在科学研究中容易造成误差，影响试验的可重复性；FBS作为一种外源性血清，应用于临床可能引起免疫排斥反应，甚至可能将牛的病毒、细菌等病原体传播至人。所以，MSCs应用于临床前不宜用FBS进行体外培养。从目前研究成果可以看出，大部分的研究者认为PRP可以替代FBS应用于MSCs的体外扩增。PRP在促进MSCs大量增殖的过程中，不改变细胞的性状，维持MSCs的免疫抑制能力和多向分化能力。下一步，应对PRP的制备方法和性状进行标准化，进一步提高科研和临床工作的可靠性和重复性，以利于大量制备和商业推广。

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