线粒体途径介导血小板凋亡的研究进展

袁 媛(综述)，张 凤(审校)

(蚌埠医学院第一附属医院血液内科，安徽 蚌埠 233004)

细胞凋亡又称程序性细胞死亡，其受细胞内源性基因、酶类及信号转导途径的调控。细胞凋亡不是病理状态下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动采取的一种死亡过程。细胞凋亡是多细胞有机体生长发育、细胞分化、内环境稳定及生理和病理性死亡的重要机制，对机体有十分重要的意义。作为血液中的重要成分，血小板在止血、调控肿瘤转移及炎性反应等方面发挥重要作用，而血小板凋亡对血小板功能有重要影响。

1 血小板凋亡概述

1997年，Vanags等[1]研究发现无核血小板亦可发生凋亡。血小板没有细胞核，但其含有有核细胞凋亡所需的多种蛋白，并且其线粒体及核糖体使其具有一定的蛋白质合成能力。通过调节蛋白质水平及活性的变化，血小板可自主调控应对外界刺激。

细胞凋亡过程可分为开始阶段及效应阶段。开始阶段包括死亡受体通路介导的外始式途径及线粒体通路介导的内始式途径。一旦被激活，两条通路就会发挥协同作用，激活胱天蛋白酶(caspase)家族进入效应阶段，导致细胞的程序性死亡，最终细胞被破坏和吞噬。研究发现[2]，血小板凋亡也可分为内始式途径及外始式途径，其中，内始式途径在血小板凋亡中起主要调控作用。外始式途径仍不太清楚，需要进一步研究。

2 血小板凋亡的诱导因素

目前已知的血小板凋亡的诱导因素包括生理性及病理性刺激因素。研究发现，高剂量的凝血酶通过蛋白酶激活受体介导血小板凋亡[3]。部分促血小板活化的因子，如血小板膜糖蛋白GPⅠbα等也可促血小板凋亡[4]。血浆中血管性血友病因子与血小板膜糖蛋白GPⅠbα受体的相互作用可促使血小板凋亡。其他还包括病理性的高血流剪切力[5]、胶原、花生四烯酸、腺苷二磷酸、腺苷酸二磷酸[6]、白藜芦醇[7]、钙离子载体A23187、血栓素类似物U46619和血小板储存条件[8]等。研究发现[2]，病理性的血管高剪切力及A23187诱导血小板凋亡的作用较强，而凝血酶、腺苷二磷酸、花生四烯酸、胶原等诱导血小板凋亡的能力相对较弱。可见，生理性刺激剂诱导血小板凋亡的作用明显弱于化学制剂等非生理性刺激因素。

3 血小板凋亡的内始式途径

多项研究证实，化学诱导剂通过内始式途径(即线粒体途径)引起血小板凋亡，主要包括以下过程：①线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm)去极化，这是凋亡的早期表现及特征性改变；②线粒体通透性转换孔形成，而后有多种线粒体蛋白转移至胞质发挥调控血小板凋亡的作用；③凋亡前蛋白(Bax、Bak及Bid)表达、活化并易位至线粒体；④线粒体膜间隙释放细胞色素C至胞质；⑤caspase-9活化[2]。部分化学刺激还可引起线粒体外部下游变化，如caspase-3活化、钙结合微丝蛋白gelsolin裂解、血小板膜表面磷脂酰丝氨酸外翻表达、血小板皱缩及血小板微粒脱落。有研究表明，白藜芦醇(resveratrol)引起caspase-8活化导致血小板发生凋亡[7]。

4 血小板凋亡的执行

4.1caspase家族 caspase平常以酶原形式存在，活化后可特异性地切断天冬氨酸残基后的肽键。caspase家族分为两类：一类为起始者，在接受到信号后可通过自剪接或自催化的方式激活，引起caspase级联反应；另一类为执行者，引起胞内的结构蛋白及功能蛋白降解。两者之间存在着“上下游”关系。多数血小板凋亡诱导剂都能促使血小板内caspase-3等活化，而抑制caspase-3则可逆转血小板凋亡。然而也有研究显示，血小板会发生caspase-3非依赖的凋亡[9]。钙依赖中性蛋白酶(calpain)酶切caspase-3的活化位点，使其活化受到抑制，而calpain替代caspase-3降解细胞内相应蛋白。两者在血小板凋亡中的独立或协同作用机制还需进一步研究。

4.2calpain 研究表明，calpain抑制剂可阻止A23187等刺激剂诱导的血小板凋亡，而calpain激活剂直接激活calpain就可诱导血小板凋亡[10]，说明calpain参与调控血小板的凋亡。然而有研究显示[11]，calpain抑制剂calpeptin可明显抑制血小板微颗粒的释放及部分蛋白发生降解，但不能影响线粒体膜电位的下降、caspase-3活化及磷脂酰丝氨酸外翻。该研究由此推断，在血小板凋亡中可能存在calpain依赖及calpain非依赖的两条信号通路，两者分别依赖不同的诱因，或者两者同时发挥作用[11]。

4.3细胞骨架蛋白 细胞骨架蛋白不仅在参与细胞运动、维持细胞形态及调节细胞通道蛋白的功能等方面发挥关键作用，还是细胞内多种调节信号的中介体。研究显示，在血小板凋亡过程中，活化的calpain及caspase-3可裂解细胞骨架蛋白，影响血小板内部结构的有序性，进而导致凋亡[10]。

4.4微颗粒释放及血小板皱缩 血小板凋亡可引起细胞膜上磷脂酰丝氨酸外翻，还会使细胞膜形成囊泡，释放血小板微颗粒[12]。通过电镜观察或流式细胞仪可检测到血小板微颗粒释放及血小板皱缩，两者是血小板凋亡的形态学表现。血小板活化时释放的微颗粒具有高促凝活性，但目前还不清楚其凋亡时释放的微颗粒成分。

此外，在血小板凋亡进程中也可检测到细胞色素C及凋亡酶激活因子1[10,13]等，其参与血小板凋亡的机制还需进一步研究。

5 血小板凋亡的调控

血小板凋亡是十分复杂的生物过程，有多种重要的生物分子参与其中。同时，血小板凋亡受到多种调节因素的调控，抗凋亡因子和促凋亡因子的共同调节使血小板凋亡得以按程序性进行。

5.1B细胞淋巴瘤/白血病2家族 B细胞淋巴瘤/白血病2(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)家族按照功能可分为促凋亡蛋白(Bak、Bax等)及抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-x等)两类[14]。两者在内始式途径调控血小板凋亡过程中发挥重要作用。促凋亡蛋白平时以非活性形式分布于胞质，当诱导凋亡因素刺激血小板后，其会在某些蛋白酶的作用下从胞液易位到线粒体外膜上，并且其在胞内的浓度亦增加，打破了Bcl-2家族抗凋亡蛋白及促凋亡蛋白之间的平衡，使得抗凋亡蛋白丧失抑制活性，同时伴随发生血小板线粒体的功能障碍，最终导致血小板凋亡[15]。

1997年，Vanags等[1]首次报道了血小板内存在Bcl-2家族成员。直到2007年，有学者利用Bcl-2家族基因敲除的小鼠研究血小板凋亡，明确了抗凋亡蛋白Bcl-x是血小板存活的关键调控蛋白[15]。Bcl-x和促凋亡蛋白Bax以类似“开关”的方式调控血小板的存活：当Bcl-x降解导致胞内水平下降时，血小板会通过Bak的作用凋亡，使用Bcl-x的抑制剂的体外实验可观察到血小板凋亡现象，体内实验发现动物体循环中血小板数量明显下降[15]。此外，Bak/Bax的基因剔除小鼠对诱导凋亡试剂有明显的抵抗性，证实凋亡的发生依赖于血小板内的Bak及Bax。但与有核细胞不同，血小板内含有一个BH(Bcl-2 homology)同源结构域(BH3-only亚家族成员Bim及Bid)，不能激活Bax，在内始式途径介导的血小板凋亡中不发挥作用[16]。Bcl-2家族能在线粒体膜上形成类似于线粒体通透性转换孔的孔洞，直接诱导线粒体膜电位下降。Bcl-2家族或线粒体通透性转换孔可能独自或协同发挥作用，参与调控血小板ΔΨm的下降。这些调控机制还需进一步研究。

5.2钙离子 钙离子在血小板凋亡中的作用取决于刺激剂的种类。新型抗癌因子BH3模拟分子ABT-737可以通过调节Bcl-2家族中的Bax或Bak的作用诱导细胞凋亡。研究表明，钙离子可能不参与ABT-737诱导的血小板凋亡[17]，但其在钙调蛋白抑制剂诱导的血小板凋亡中则起重要调控作用[18]。

6 研究血小板凋亡的意义

血小板凋亡与机体的多种生理功能及病理过程密切相关。凋亡可能是血小板在体内清除的重要途径之一。在病理情况下，血小板凋亡可引起机体凝血异常。研究显示，血小板凋亡及功能异常可能是高热患者出血的原因之一[19]，也可能是他莫西芬等抗癌药导致出血的原因[16]。Sener等[20]研究发现，高脂血症患者的血小板凋亡及活化同时发生使其发生动脉血栓形成性脑梗死的可能性升高。Sobol等[21]研究发现，行血透的尿毒症患者存在血小板凋亡。此外，研究发现凋亡可能是导致库存血小板失活的重要因素[7]。

7 展 望

目前，对细胞凋亡的研究不断深入，其检测指标更加明确。随着多种检测试剂盒的应用，对细胞凋亡的检测手段更加丰富，检测方法更简便灵敏。作为血小板研究领域的重要组成部分，血小板凋亡的研究将为延长血小板保存时间以及血栓与出血性疾病的防治等方面提供理论依据。血小板凋亡的研究成果有可能提高相关疾病的诊疗水平或应用于指导新药设计。因此可以预测，对血小板凋亡的研究会有广阔的前景。

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