人β-防御素3的研究新进展及其与疾病的关系

张晓艳(综述)，司利钢(审校)

(哈尔滨医科大学附属第一医院儿内科一病房，哈尔滨 150001)

防御素是近年来发现的一类内源性小分子多肽,迄今为止共发现五类：α-防御素、β-防御素、θ-防御素、植物防御素和昆虫防御素。人类防御素包括α-防御素、β-防御素。β-防御素在人体皮肤和黏膜上皮组织中广泛表达。其分子结构稳定，能够快速、准确地识别并中和侵入机体的革兰G+、G-细菌,真菌、包膜病毒和某些寄生虫产生较强的杀伤作用，是宿主发挥天然免疫的重要组成部分。此外，β-防御素还可以作为趋化因子连接先天性免疫和获得性免疫应答，在人体多种疾病中发挥重要作用。

人类β-防御素有多种，但研究明确的包括β-防御素1～6，其中β-防御素3(human β-defensin-3,HBD-3)是2001年Harder等[1]在银屑病患者皮损组织中采用金黄色葡萄球菌亲和柱层析法首次分离纯化发现的。与其他防御素成员相比，HBD-3具有更广的抗菌谱和更强的抗菌活性。其杀菌作用迅速，对盐浓度相对不敏感，对宿主毒性低，可通过Toll样蛋白受体(Toll-like receptors，TLR)连接先天和获得性免疫应答,在保护黏膜和上皮细胞免受感染中起着重要作用，具有很高的应用价值。

1 HBD-3基因及蛋白结构

HBD-3基因定位于人第8号染色体的p22～23区域内,位于HBD-2基因上游13 kb处,包括2个外显子和1个内含子。HBD-3是由45个氨基酸残基组成的小分子阳离子短肽,分子质量为5154.7,含有6个保守的半胱氨酸残基[2]。它的三级结构包括一个α螺旋、三个反向平行的β-折叠，组成特征性的“防御素样”折叠。并在空间上形成分离的疏水性和亲水性区域，疏水端聚集在肽表面的底部,正电荷在其表面两端呈不对称分布[2-3]。

2 HBD-3分布与表达

人β-防御素根据表达方式不同可分为组成型表达(如HBD-1)和在炎症和病原体刺激下的诱导型表达(如HBD-2-4)[1,4,5-7]。HBD-3在上皮细胞中除了组成型表达外，亦可成诱导型表达。

HBD-3是从银屑病患者的皮肤鳞屑中首次被分离出来的，后期一些科学家也在角质细胞和经过铜绿假单胞菌预处理后的肺上皮细胞中分离得到。在正常皮肤和上皮组织中，HBD-3基因表达水平较低，但当机体受到外界病原体侵袭时，HBD-3 mRNA的表达水平成倍增加，抵御病原体入侵，促进机体自身修复。

Dunsche等[8]通过反转录聚合酶链反应在不同机体器官中分析HBD-3的基因表达，发现HBD-3 mRNA在皮肤、舌、气管和扁桃体中有较强程度的表达，而在唾液腺、子宫、肾、骨髓、胸腺、结肠、胃、咽喉部及泌尿生殖道等器官内的表达水平较低。HBD-3可在眼上皮细胞中被诱导表达，并且实验显示，在角膜和结膜感染样本其表达程度显著高于非感染样本[9]。

在人类子宫内膜上皮细胞中，HBD-3的表达情况与月经周期的阶段相关，在分泌阶段的早期和晚期的表达能够达到最高水平[10-11]。

HBD-3在非感染状态下表达水平较低，难以抵御外源性致病菌的入侵。多个实验证实，HBD-3的表达受外界刺激的诱导后，其在上皮细胞中mRNA呈不同水平的增加。这些刺激因素包括白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、干扰素γ、白色念珠菌、人免疫缺陷病毒以及革兰阳性和阴性菌等[12-15]。Harder等[1]分别利用铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和肿瘤坏死因子α刺激呼吸道上皮细胞和A549肺泡上皮细胞引起损伤后,发现HBD-3在损伤的细胞中表达增强。

3 HBD-3的生物学活性

3.1抗微生物活性 HBD-3能直接杀灭侵入机体的病原微生物，包括细菌、真菌、病毒、支原体、螺旋体和某些寄生虫等。虽确切的作用机制尚未明确，但目前科学家普遍认为HBD-3通过离子通道发挥作用。具体是指HBD-3分子表面的正电荷吸附于带负电荷的微生物表面，破坏细胞的磷脂双分子层，并插入其胞膜，形成多个孔隙或通道，导致微生物细胞内大分子及盐类外流，最终导致不可逆的菌体死亡[16]。人体细胞由于细胞膜表面负电荷的含量明显低于致病微生物，可免受攻击。HBD-3在较低浓度时即可形成二聚体，且表面所携带的正电荷明显高于HBD-2、HBD-1，因此HBD-3的抗微生物活性显著强于其他两种防御素。此外，有研究报道，HBD-3对耐药菌株也有较高的抗菌活性[17]。丁克元等[17]研究不同浓度的重组人β-防御素-3(rHBD-3)对呼吸道耐药菌株的抑菌活性，结果显示：rHBD-3对临床多耐药菌株具有显著抗菌作用，对不同细菌的最小抑菌浓度值浓度在0.004～0.016 μg/L，这些耐药菌株包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌。已有研究表明,人上皮细胞HBD-2和HBD-3通过直接与病毒粒子相互作用和调节免疫活性细胞上复合受体CXCR4阻断了人类免疫缺陷病毒1复制[18]。该研究小组进一步研究发现，HBD-3是人类免疫缺陷病毒1复合受体 CXCR4的拮抗剂[19]。

3.2免疫调节机制

3.2.1在先天性免疫中的作用 HBD-3能提高吞噬细胞的吞噬能力，通过直接杀伤病原体发挥作用。HBD-3可对单核细胞、树突状细胞、T细胞等发挥趋化作用[20]。此外，HBD-3还可以调节肥大细胞、上皮细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等细胞的活性，这些细胞均参与先天性免疫。

3.2.2在获得性免疫中的作用 HBD-3属于天然免疫的重要组分，同时也是联系获得性免疫的桥梁。HBD-3是细胞介导的获得性免疫的效应分子，具有免疫激活及增强的活性。Funderburg等[21]研究发现,HBD-3通过与TLR1和TLR2相互作用,趋化诱导或直接激活抗原递呈细胞(如树突状细胞),从而激活T细胞,增强特异性免疫应答。

4 HBD-3在各种疾病中的作用

HBD-3在人体表达广泛，且具有较强的抗微生物活性，并能促进伤口愈合，发挥免疫调节及抗肿瘤等多种作用。随着研究的深入，HBD-3在多种疾病中的作用引起科学家们的极大兴趣，以下就几种常见病简要概述。

4.1呼吸系统疾病 支气管上皮细胞及肺泡上皮细胞可产生HBD-3，参与呼吸道免疫反应。在非感染状态下，其表达水平较低，但经过脂多糖或细菌等直接刺激后HBD-3表达增加，通过激活抗原呈递细胞，增强单核-巨噬细胞系统的抗菌活性。Ishimoto等[22]研究发现，在细菌性肺炎患者感染急性期，HBD-3的表达水平增加，恢复期表达水平降低。王曼知等[23]研究发现，HBD-3 mRNA在脂多糖刺激后1 h内表达迅速增加，推测在细菌侵袭呼吸道后，HBD-3在短时间内可被诱导表达，从而参与呼吸道初期的防御反应。这也为HBD-3作为感染急性期反应蛋白应用于临床提供了理论依据。该实验同时发现脂多糖对HBD-3的诱导表达有时效性，而且细菌侵袭时间越长，HBD-3被诱导表达越多，说明机体受到外界病原体入侵时，即可通过自身防御机制增强HBD-3的表达起到抗感染作用。此外，HBD-3抗菌作用不依赖盐离子浓度，故呼吸道黏膜内的高盐离子对其表达影响不大。综上所述，HBD-3在呼吸道感染性疾病中具有极其重要的作用。

4.2消化系统疾病 克罗恩病是炎症性疾病，确切的发病机制迄今尚未阐明。健康机体消化道内存在双歧杆菌等益生菌，对维持机体内环境稳定发挥重要作用。在健康人群中，HBD-3维持人与这些共生细菌之间的互惠关系。研究发现，克罗恩病患者防御素表达水平紊乱，从而使共生细菌变成致病菌，导致胃肠道感染与疾病[24]。在肠易激综合征患者中，防御素水平表达下降[25]。溃疡性结肠炎患者长期受到炎症刺激也可以出现血浆HBD-3的高表达[26]。

4.3皮肤病 在某些皮肤疾病(如银屑病、乳腺炎)中，抗菌肽HBD-2和HBD-3的表达增加；这些高水平防御素对皮肤病患者具有保护性作用，从而降低其感染发生率[27-28]。然而，特应性皮炎患者的皮肤状况表现为HBD-2和HBD-3水平下降，这类患者细菌、真菌、感染概率明显增加[27]。

4.4囊性纤维化 囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)是由可编码调节氯离子通道的 CF跨膜转导调节蛋白基因突变导致的一种致死性隐性遗传病。CF患者的主要死因是呼吸衰竭，可能是反复感染和炎症导致的肺和呼吸道累积损伤。由铜绿假单胞菌所引起，肺部病变呈渐进性进展。感染大多数只定位在肺部，表明局部上皮宿主防御反应存在缺陷。目前认为这种缺陷是由CF呼吸道液体中盐离子状态异常导致的防御素活性被抑制引起的。正常的呼吸道液体中为低盐状态，有利于防御素活化，但是CF液体中因为形成氯离子通道的CF跨膜转导调节蛋白缺乏功能而导致高盐状态，这种高盐环境会降低HBD-1、HBD-2的抗菌活性，而HBD-3是非盐离子浓度敏感型,在任何盐浓度下均能表现出良好的抗菌活性。因此,推测HBD-3对于CF患者的治疗可能有益[3]。

4.5肿瘤 目前肿瘤与HBD-3的研究多局限于离体细胞层面或动物实验。Shnitsar等[29]研究发现，在人外阴肿瘤A431细胞中HBD-3 mRNA表达增加。该研究通过反转录聚合酶链反应发现，在被表皮生长因子激活的A431细胞系中HBD-3 mRNA的表达明显升高,提出肿瘤组织可能在生长因子的激活下引起HBD-3 mRNA的高表达，并且发现上皮组织在感染或炎症的反复刺激下发生恶变,可能通过脂多糖或白细胞介素1途径引起HBD-3 mRNA表达上调。林玲[30]采用免疫组织化学法研究HBD-3在非小细胞肺癌组织中的表达，结果显示：癌组织中有高水平的HBD-3蛋白表达，且水平显著高于癌旁正常组织。同时该研究就不同组织病理学分型的肺癌标本进一步分析，结果显示鳞状细胞癌组织中HBD-3的阳性率高于腺癌，并推测HBD-3可能通过趋化诱导未成熟树突状细胞而在肺癌肿瘤免疫中发挥重要作用。国内外研究证明，HBD-3在肿瘤的发生、发展中具有一定的作用，具体机制尚需进一步探讨[29-30]。

4.6外科疾病 术后手术部位感染是外科手术最常见的并发症，徐宇等[31]通过酶联免疫吸附试验检测骨折手术部位感染患者血浆HBD-3的水平变化，结果显示骨折手术部位感染患者血浆HBD-3水平降低，统计分析显示低水平的HBD-3可能是骨折手术部位感染的危险因素，其机制可能与HBD-3减少所致的机体防御功能下降有关。急性胆囊炎、急性阑尾炎是外科常见急腹症，多由化学性刺激及细菌感染等因素引起。王冲杰等[32]研究发现，急性胆囊炎患者血浆的HBD-3水平显著低于健康体检者，同时坏疽性胆囊炎患者血浆HBD-3显著低于非坏疽性胆囊炎患者。多因素分析显示，血浆HBD-3水平是患有急性胆囊炎及坏疽性胆囊炎的独立危险因素；ROC曲线分析显示，HBD-3水平对于预测罹患急性胆囊炎及坏疽性胆囊炎有显著预测价值。该研究推测，HBD-3可能是急性胆囊炎发生的危险因素，参与急性胆囊炎的发病过程。用同样的方法，黄卫荣等[33]研究急性阑尾炎患者血浆HBD-3水平得出与上述研究类似的结论。Brancatisano等[34]试验显示，牙周炎患者HBD-3表达水平明显降低。对血浆HBD-3水平降低的人群加强一级预防可一定程度上减少胆囊炎、阑尾炎、牙周炎的发病率，同时可以预测上述疾病的发病情况，进行早期干预。

5 小结与展望

HBD-3作为机体的一种活性物质，相对不具有免疫原性，病原菌也不易对其产生耐药性，是一种新型高效的抗菌物质，在不远的将来有望成为替代抗生素发挥广谱高效的抗菌作用。同时HBD-3可以调节机体的免疫应答和炎性反应，促进组织创伤修复，可以诱导机体HBD-3的表达，增强机体抗感染能力和免疫力，在许多疾病中发挥重要的作用。目前HBD-3的生物学功能大部分都是基于体外研究，体内应用途径及治疗价值还需要通过相应动物及临床试验深入探索。此外，如何获得大量有活性的HBD-3蛋白及了解其细胞毒性和适宜剂量仍是研究者面临的重大问题。但坚信随着基因工程的迅速发展，对重组HBD-3性质及机制的深入研究，将为解决愈加严峻的细菌耐药问题提供一线曙光，为多种临床疾病的治疗提供新方法。

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