代谢组学在口腔医学领域的研究进展

李 姣 综述;周京琳，丁 一 审校

(四川成都610041:1.四川大学华西口腔医院牙周科;2.四川大学华西口腔医院颌面外科)

代谢组学(metabonomics/metabolomics)是20世纪90年代发展起来的研究生物体或细胞代谢产物谱变化的一种新的系统方法［1］，它作为一种新兴的组学与基因组学、转录组学、蛋白质组学共同构成了系统生物学［2］，这些组学分别研究生命过程的不同层面，从而更深层次地认识生命现象及其发展规律，探讨生命的本质。近年来，随着硬件仪器检测效率的不断提高、分析方法和软件的不断改进升级，全面加快了从高通量样品分析到完成海量数据分析的整个研究过程，从而使代谢组学逐渐成为医学领域中疾病风险预测、病理机制、疾病诊断等方面的研究热点。代谢组学近年来也被引入口腔医学进行探索性研究，并取得一定的研究成果，本文就代谢组学的理论基础、研究方法及其在口腔医学领域中的研究进展作一综述。

1 代谢组学的理论基础及优势

生物体是一个完整复杂的系统，其生物分子组织和调控水平相互关联、相互依赖，并受内外环境等因素的影响，每个部位的变化都可引发局部或整体生命活动的变化，从而引起生物体代谢产物的改变。代谢组学可对某一生物体或细胞在一特定时期内所有低分子量(MW＜1 000 Da)内源性代谢产物同时进行定性和定量分析，并以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标，研究生物体或细胞的动态代谢变化，特别是内源代谢、遗传变异、环境变化以及各种物质进入代谢系统的特征和影响［2］。通过代谢组学研究既可以发现生物体在受到各种内外环境扰动后的应答不同，也可以区分同种不同个体之间的表型差异;并能用反映整体的代谢物谱图直接展现生理或病理状态，提供区别于其他“组学”所带来的大量生化信息。与其他“组学”相比，代谢组学具有以下优势:①基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物水平得到放大，更易于检测出;②代谢组学的研究不需要进行全基因组测序或建立大量表达序列标签的数据库;③代谢物的种类远少于基因和蛋白的数目;④因所有生物体的代谢物种类相同，研究中采用的技术更通用［3］。

2 代谢组学的研究方法

代谢组学的研究步骤包括:样本的采集和预处理、代谢产物检测和数据采集、数据预处理和分析、生物标志物识别和代谢途径分析。这里仅对检测技术和分析方法做简要介绍。

2.1 检测技术

完成样本的采集和预处理后，需要对样本中的代谢物进行检测。与其他组学技术只分析检测特定类型的化合物不同，由于代谢组学所分析检测的化合物在大小、数量、官能团、挥发性、带电性、电迁移率、极性以及其他物理化学参数方面的差异很大，所以要求其检测方法应具有高灵敏度、高通量和无偏向性的特点。用于代谢组学研究的检测技术有核磁共振(NMR)、质谱(MS)、气相色谱(GC)、液相色谱(LC)、毛细管电泳(CE)、红外光谱(IR)、电化学检测(ECD)及其组合联用等各种手段。但由于代谢产物和生物体系的复杂性，目前尚无一种技术能满足上述所有的要求，因此越来越多的学者均推荐采用联用技术或多种方法综合分析［4-6］。

NMR是当前代谢组学研究中的主要技术，其优势在于能够对样本实现无创性、无偏向的检测，而且样本预处理相对简单，具有较高的通量和较低的单位样本检测成本;并能分别检测化合物中的1H、2H、13C、31P、15N、19F 等核素。另外，由于其中的1H-NMR对含氢化合物均有响应，所得氢谱的谱峰与样本中各化合物一一对应;谱图中信号的相对强弱可反映样品中各代谢物结构的相对含量，因此能完成样品中大多数化合物的检测，从而满足代谢组学研究中对尽可能多的化合物进行检测的目标［1，7］。NMR 的缺点是:与 MS相比检测灵敏度相对较低，检测动态范围有限，低丰度代谢物信号易受到高丰度代谢物信号的掩盖。

与NMR相比MS具有较高的灵敏度和特异性，适于大量低丰度代谢物的分析鉴定。随着质谱及其联用技术的发展，多数学者已将色谱-质谱联用技术(Chromatography-Mass Spectrometry)用于代谢组学的研究［5-6，8］。GC-MS 在植物学、疾病诊断等领域应用广泛，该技术不仅具有较高的分辨率和检测灵敏度，同时还有可供参考比较的标准谱图数据库，使之易于得到待分析代谢组分的定性结果。但应用GC-MS进行检测时，需要先对样本进行衍生化预处理，不仅其步骤繁琐，且会导致样本易产生变化，不能分析热不稳定物质和一些大分子代谢产物。LC具有强大的分离能力，基于LC-MS技术的分析方法十分适合代谢组学样本的分析，且该技术避免了衍生化的步骤，适用于热不稳定、不易挥发、不易衍生化和分子量较大的物质［5，8-9］。

近几年基于NMR或MS发展的其他检测技术，如高分辨魔角旋转(HR-MAS)［10］、超高效液相色谱/高分辨飞行时间质谱(UPLC/QTOF-MS)［11］、基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOFMS)［12］、傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)［13］、高效液相色谱/电喷雾质谱(HPLC-ESI-MS/MS)［14］、薄层色谱/气相色谱与氢火焰离子化检测器质谱(TLC/GC-FID-MS)［15］、快速蒸发电离质谱(REIMS)［16］等也被广泛用于代谢组学研究，以提高代谢产物检测的分辨率、灵敏度、动态范围和通量，从而获得更加准确和完整的样本信息。

2.2 分析方法

由上述测试分析仪器导出的是信息含量丰富的多维数据，不能直接用于分析，需对采集的多维海量原始信息进行压缩降维和归类分析，从中挖掘出有用信息。主要的数据预处理包括滤噪、重叠峰解析、峰匹配、标准化和归一化等(但并不是所有步骤都需要进行，而是根据实际情况选择几种)，最后提取出二维矩阵数据表，表中的行代表样品或实验数目，列表示相应的单个测定指标(通常为代谢物的信号强度等)［17］。数据分析过程中应用的主要手段为模式识别技术(PRA)，包括非监督性模式识别和监督性模式识别［18-19］。

非监督性模式识别用于预处理后的数据信息中对样本进行归类，并采用相应的图表直观地表达出来，不需要有关样本分类的任何背景信息。该方法将得到的分类信息和这些样本的原始信息进行比较，建立代谢产物与这些原始信息的联系，筛选与原始信息相关的生物标志物，进而考察其中的代谢途径，常用的方法是主成分分析(PCA)。

监督性模式识别用于建立类别间的数学模型，使各类样本间达到最大的分离，并利用建立的多参数模型对未知的样本进行预测(即由已知有效推测未知)，常用的方法是独立软模式分类(SIMCA)和偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)。

PCA和PLS-DA是代谢组学研究中最常用的模式识别方法，这两种方法通常以得分图(score plot)获得样本分类的信息，以载荷图(loading plot)获得对分类有贡献变量及其贡献大小，从而发现可作为生物标志物的变量。目前软件商或仪器制造商已开发出多种相关代谢组学数据处理分析软件，利用这些软件使得数据信息处理过程更加快速和自动化［20］。

与基因组学和蛋白质组学相似，代谢组学的生物标志物识别和代谢途径分析均离不开各种生物化学和代谢途径数据库。但目前代谢组学专用数据库的内容和功能并不完善，只能利用其他生化和代谢途径数据库对样本中未知代谢物进行结构鉴定或已知代谢物的生物功能解释。理想的代谢组学数据库应包括各种生物体的代谢物组信息以及代谢物的定量数据，数据库中每种代谢产物都有其相应的化学、临床、分子生物学和生化数据。例如由加拿大阿尔伯塔大学研究者建立并持续补充完善的人类代谢组数据库(the human metabolite database HMDB，www.hmdb.ca)［21］，该数据库截止2012年已收录40 000多种代谢物。

3 代谢组学在口腔医学领域的研究应用

随着代谢组学的不断发展，其研究优势和前景被越来越多的学者所认知，在口腔医学领域中的相关研究也日益增加。常用于检测分析的样本主要为含有大量代谢产物的生物体液，如血浆(血清)、唾液、龈沟液、尿液、口腔微生物(牙菌斑)培养液以及细胞培养液。

3.1 口腔致病微生物检测

Takahashi等［22］利用CE-MS对龈上菌斑和口腔常见菌(链球菌、放线菌)的糖代谢系统的相关机理进行了研究，结果显示，龈上菌斑与链球菌、放线菌的代谢途径和代谢产物相似:均为乙酰辅酶A以及糖酵解途径中的葡萄糖-6-磷酸、1，6-二磷酸果糖等和磷酸戊糖途径中的6-磷酸葡萄糖、核酮糖-5-磷酸等增加;糖酵解途径中的3-磷酸甘油酸酯、磷酸烯醇丙酮酸和三羧酸循环中的琥珀酸、延胡索酸等减少。

熊萍［23］、鲁维希［24］、李兵等［25］分别在液体培养基中接种相同密度的不同龋病、牙周病、黏膜病相关致病菌，选择细菌生长稳定期的培养液行1H-NMR检测，数据分析显示:各组数据内部均有集中的类聚关系，可以分别区分龋病、牙周病、黏膜病相关致病菌中不同种属的细菌，提示代谢组学在口腔致病微生物的快速鉴定中有良好应用前景。

3.2 牙周病

Barnes等［26］分别采集健康、牙龈炎和牙周炎位点的龈沟液，并以LC-MS与GC-MS联合的方法进行分析，结果显示:牙周炎位点的抗氧化剂和谷氨酸减少，嘌呤降解和鸟氨酸循环增加;同时还发现了一些与牙周炎进展相关的生物标志物。鉴于嘌呤降解途径是活性氧产物的主要来源，其明显加速提示牙周炎引起的氧化应激和炎症是通过该途径调节的，由此作者提出了“细胞代谢产物的改变是宿主-细菌相互作用的结果”这一新的观点。此后该课题组［27］又分别采集使用三氯生牙膏和普通牙膏后的牙周炎患者的健康、牙龈炎、牙周炎位点处的龈沟液，并对之前研究中有统计学意义的10种代谢标志物进行检测，结果显示:实验组最早在第1周时其牙龈炎位点的肌苷、赖氨酸、腐胺和黄嘌呤水平即出现降低，而对照组则无改变。以上结果说明，在出现临床改变之前三氯生就引起了生物标志物的明显改变，提示通过检测这些生物标志物的水平，可对疾病的状态进行评估和预测。

Aimetti等［28］将通过临床和放射检查诊断为广泛型慢性牙周炎患者唾液的1H-NMR数据与牙周健康者进行分析比较时发现:与牙周健康者相比，广泛型慢性牙周炎患者唾液中的醋酸盐、γ-氨基丁酸等浓度均明显增高，而丙酮酸盐、N-乙酰类的浓度则明显降低。

3.3 口腔癌

Sugimoto等［29］分别收集口腔癌、胰腺癌、乳腺癌、慢性牙周炎患者和健康人的唾液，采用CE-TOF-MS联合的方法共认定了57种主要代谢产物，经分析显示，3种癌症患者唾液中所检测到的多数标志物浓度均明显高于牙周炎和健康组;提示肿瘤的特征性改变包含在唾液代谢产物中，这些代谢产物有望作为生物指标用于疾病的预测和筛查。

Zhou等［30］采用1H-NMR 对口腔鳞癌患者和健康人血液代谢物进行分析比较时发现:与健康者相比，口腔鳞癌患者血浆中核苷酸的合成明显加强，氨基酸和核苷酸的分解代谢显著降低;糖类的合成也相对降低，糖酵解异常。

Wei等［11］分别收取口腔鳞状细胞癌患者、口腔白斑患者和健康人的唾液样本，利用UPLC/QTOF-MS进行检测，并从中选取5种已知有意义的生物标志物进行分析，结果显示:3组的代谢物均有明显差别，其中口腔鳞状细胞癌与白斑相比5种标志物中的乳酸增加，缬氨酸、苯基丙氨酸减少;提示唾液代谢物检测可作为临床上口腔鳞状细胞癌和口腔黏膜白斑分级诊断的辅助检查，也可作为预后评估的参考。

3.4 唇腭裂

Zhou等［31］利用1H-NMR对孕期分别腹腔注射地塞米松和生理盐水的C57BL/6J雌鼠的血浆进行检测发现，C57BL/6J孕鼠在地塞米松干预下其妊娠过程中的代谢物组发生了变化，各代谢产物与对照组相比均有明显差异，说明地塞米松扰乱母体代谢可能在引发胎儿唇腭裂中有重要作用;提示利用代谢组学方法检测母体孕期代谢变化可以早期发现胎儿的唇腭裂情况。

3.5 其他

Huang等［12］采用 MALDI-TOF/TOF-MS 研究经胰蛋白酶消化后的人唾液蛋白/多肽，并通过搜索相关数据库鉴定出63种唾液肽与相应22种唾液蛋白，经分析发现:带有脯氨酸(Pro)-谷氨酸盐(Gln)C-终端(-PQ C-termini)结构的肽类为人唾液中的固有成分，该类多肽能与口腔细菌结合并表现出固有免疫的特点，可能对固有免疫相关疾病的诊断和预后评估有一定意义。

Takeda等［32］利用1H-NMR方法研究健康人群唾液中代谢物浓度时发现，同一非吸烟男性的刺激性唾液中的代谢物浓度均高于其非刺激性唾液;吸烟男性与非吸烟男性相比，唾液中的柠檬酸盐、乳酸盐等浓度均增高，甲酸盐浓度降低;男性与女性相比，唾液中的醋酸盐、甲酸盐等浓度均增高。

牙合垫治疗(template therapy)可治疗颞下颌关节紊乱症、头痛等多种症状和疾病，为研究其治疗机制，Tanaka等［33］利用 CE-TOF-MS对一名头痛女性患者治疗前和经治疗症状缓解后的唾液进行分析发现，治疗后唾液中甘氨酸的浓度增加，其他氨基酸无明显变化，说明甘氨酸在牙合垫治疗中具有重要作用。

4 展望

随着代谢组学的优势被越来越多的学者所认知，已涉及到许多领域并成为研究热点。而且该技术与能与基因组学、转录组学和蛋白质组学等相关研究相结合，正朝着整合一体化、定量化和标准化的方向发展。基于NMR或MS开发的新检测技术，改进的统计分析方法以及代谢组学数据库的不断补充和完善等发展趋势都有助于提高样本检测分析的效率和准确性，并可为今后的分析研究提供更多的便利。由于生物体液中代谢产物的成分复杂多样，将代谢组学与其他组学相结合对样本中的代谢产物进行分类分析(如高丰度蛋白、低丰度蛋白、脂类、糖类等)，以减少不同类物质间的信号干扰、缩小研究范围，使之更容易寻找出特异性生物标志物，可能成为今后代谢组学研究的一个方向。通过目前的研究报道可看出，代谢组学在口腔疾病的致病机制研究、风险预测、筛查、诊断、病理分级和预后评估以及口腔致病微生物的快速鉴定中均显示出其他研究方法所不具备的优势，尤其在目前研究较少的因全身代谢异常所导致的口腔疾病或遗传性口腔疾病，以及个性化用药指导中均有良好的研究前景，并有望应用于临床。从大量的代谢产物中找出特异性的生物标志物(特别是低丰度的标志物)是决定该技术能否在临床领域广泛应用的一个重要因素，也是今后代谢组学研究中需要重点解决的问题。

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