小鼠生物净化中的动情周期判定及超数排卵

刘青青, 牛玉娜, 周正宇, 王 婧, 卢明康, 薛智谋

(苏州大学实验动物中心, 苏州 215123)

小鼠生物净化中的动情周期判定及超数排卵

刘青青, 牛玉娜, 周正宇, 王 婧, 卢明康, 薛智谋

(苏州大学实验动物中心, 苏州 215123)

目的 准确判定小鼠动情周期的变化，并在动情周期的不同阶段诱导超数排卵，探索最佳的超排时间，以提高生物净化的成功率。方法 C57BL/6J小鼠每日08∶00至13∶00，取阴道脱落细胞进行涂片，观察脱落细胞中白细胞、有核细胞和角质化细胞的比例及变化的规律，确定小鼠的动情周期。据判定的动情周期的各阶段，腹腔注射外源激素分别诱导超数排卵后，于输卵管中取卵母细胞计数，并统计分析。结果 根据阴道涂片确定小鼠动情前期(包括过渡期)、动情期(I、II期)、动情后期和间情期。4～6周龄C57BL/6J小鼠诱导超数排卵的最佳时期是动情前期，平均可获得23.20枚卵母细胞,显著高于其他实验组(P＜0.001)。结论 据阴道涂片观察,C57BL/6J小鼠单个动情周期持续4～10d，动情周期内不同时间段超排效果也不同。

小鼠; 动情周期; 阴道涂片; 超数排卵

雌性小鼠性成熟后,生殖器官在激素的诱导下发生增生及至退化的周期性变化为动情周期。大多数文献认为小鼠动情周期一般为4～5 d，并将其划分为动情前期、动情期、动情后期和间情期四个阶段[1～3]。目前, 文献上描述较多的判定小鼠动情周期的方法有外阴直接观察法、阴道栓观察法和阴道脱落细胞涂片法三种[4～5]。但实验中发现, 小鼠动情周期各阶段的外阴变化并如文献描述那么典型而且仅能判断出小鼠处于动情前期和动情期(雌鼠接受雄鼠交配)，对于需要体外受精的实验并不完全适用。阴道涂片法判定小鼠的动情周期简单、准确，大多数有关小鼠生殖生理的文献也都提及了这个方法，但对操作方法和判定标准描述不够详尽。另外，不少文献在涂片后进行染色，而在实际实验中发现，冲洗染料的过程中，难免有细胞被洗掉, 导致判断失误, 且在样本量较多时, 步骤繁琐, 费时费力。作者初期实验结果也证明, 由于未考虑小鼠动情周期的变化直接进行超数排卵，仅少数小鼠超排是成功的，大部分小鼠超排效果不明显。基于此，本实验选取4～6周龄雌性C57BL/6J小鼠, 对其进行连续20 d的阴道脱落细胞的观察。在此基础上分别在不同动情阶段诱导超排，对探索最佳的超排诱导时期和增加小鼠的排卵数具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性SPF级C57BL/6J 小鼠39只，4～6周龄，由上海斯莱克实验动物有限公司提供[SCXK(沪) 2007-0005]

1.2 主要试剂、仪器

0.9%的生理盐水、PMSG和 hCG(宁波市三生药业有限公司)、透明质酸酶(Sigma)、75%酒精、O lympus倒置显微镜、O lympus解剖体视镜、手术器械、微量移液枪、96孔细胞培养板、60mm培养皿、1 m l 注射器

1.3 方法

1.3.1 阴道涂片 10只4～6周龄的雌性C57BL/6J小鼠, 每日8∶00～13∶00, 用微量移液枪吸取100 μl生理盐水，枪头轻触阴道口并注入阴道中，待回流时回吸，重复两三次后，液体置入96孔板中，显微镜下观察并判定动情周期。

1.3.2 诱导超数排卵 另29只4～6周龄C57BL/6J小鼠，对其进行阴道涂片观察后分为5组: 对照组(自然排卵组)、动情前期组、动情期组、动情后期组、间情期组。除对照组外，其他组分别在相应时期诱导超数排卵。第1日17∶00，腹腔注射10 U的PMSG, 46～48 h后再腹腔注射10 U的hCG。注射hCG 20～23 h后，颈椎脱臼法处死小鼠，输卵管灌洗取出卵母细胞[6～7]。

1.4 统计学方法

利用统计软件SPSS 16.0对实验数据进行t检验和One-Way ANOVA。

2 结果

2.1 动情周期各阶段阴道脱落细胞的特点

间情期向前期的过渡期: 相比间情期, 细胞总体数量下降, 最明显表现为白细胞大量减少, 圆形或椭圆形有核细胞明显可见，并且数目逐渐增多(图1A)。动情前期: 白细胞数量进一步减少, 有圆形或椭圆的有核细胞, 少或无多边形的角质细胞, 偶见退化的卵母细胞。常有粘附大量白细胞团的黏液(图1B)。动情期I: 即排卵日, 无白细胞, 有少量的有核细胞, 数量相对于上一周期开始减少, 多为多边形的角质细胞。这是最佳的取卵母细胞的时期, 此时卵母细胞团攒集于壶腹部(图1C)。动情期II: 即排卵后, 仅存在单个或片状的攒集的以及少量的竹叶状的角质细胞(图1D)。动情后期: 细胞总数增加, 存在多边形的角质细胞, 白细胞开始出现并逐渐增多; 在取阴道脱落细胞的时候，常见到白色碎片状分泌物贴满阴道内表面或半填满阴道腔(图1E)。间情期:此时细胞总数最多，镜下几乎全是白细胞，调节细准焦螺旋能看到极少量的有核细胞，也是动情周期中有核细胞出现的起始，但并不明显(图1F)。

2.2 超数排卵时期的选择

实验结果(表1)显示, 动情前期组小鼠取到的卵母细胞数目比其他组小鼠多近1倍(P＜0.001); 动情期组小鼠取到的卵母细胞数目与对照组相比差异显著(P＜0.05); 间情期诱导超排的小鼠卵母细胞数目相较于对照组无统计学差异。

3 讨论

近年来，大量基因工程小鼠从国外引进，在进入SPF级设施前通常要经过隔离检疫，如果发生污染，一般可通过剖宫产[8]和胚胎移植[9]等方法进行生物净化。

图1 小鼠动情周期各阶段的典型阴道脱落细胞涂片(×200)

表1 动情周期的不同阶段诱导超排获取的卵母细胞数

准确把握剖宫产时机，对小鼠见阴栓时间的判定要精确。对于无阴栓或阴栓不明显的，应根据阴道脱落细胞涂片中是否有精子作为小鼠是否成功交配的依据。剖宫产时间与仔鼠存活率密切相关，越接近母鼠自然分娩的时间，仔鼠成活率越高。在动情期(I、II期)见阴栓的小鼠，通常在见阴栓18.5 d时，实施剖宫产。早于妊娠18.5 d则小鼠体质弱，生存率低; 晚于18.5 d则小鼠可能出现顺产，达不到净化目的。而动情前期见阴栓的小鼠，在18.5 d时剖宫产发现70%甚至全部仔鼠在代乳后1 d死亡，需要延迟1d实施剖宫产。

胚胎移植通常需要足够多的受精卵，而常用于转基因小鼠模型的C57BL/6J小鼠正常排卵数较少(3.5 d的囊胚数约3～8枚)，一般均需进行超数排卵才能获取足够的囊胚。超数排卵的效果主要受到小鼠日龄、动情周期、生理和营养状态、光照周期的影响，并且与动情周期密切相关[6,10]。4～6周龄小鼠超排除在动情前期达到最佳效果外，在动情期超排卵母细胞数量也有一定比例的增多。可能是小鼠动情周期天数的不同，有的小鼠动情周期短，在动情期使用外源激素诱导超排能在下一个动情周期内源激素升高前起作用。间情期诱导超排，获取的卵母细胞中异形的、不正常的卵母细胞多于其他组，这和 Tarin等[11]研究的结果一致。

[1] 张森, 韦旭斌, 王新, 等. 大鼠发情周期各阶段的阴道细胞变化观察[J]. 动物医学进展, 2006, 27(2):69-72.

[2] 翟青新, 招霞, 哈惠馨. 小鼠的生殖特性及阴栓[J]. 实验动物科学, 2009, 26(2):62-67.

[3] 丁玉龙, 孙莉, 李丽亚. 小鼠阴道涂片三种染色方法比较[J]. 实验动物科学, 2010, 27(1):67-69.

[4] Byers SL, Wiles MV, Dunn SL, et al. Mouse estrous cycle identification tool and images[J]. PLoS One, 2012, 7(4):1-5.

[5] Caligioni CS. Assessing reproductive status/stages in m ice[J]. Curr Protoc Neurosci, 2009, 6:1-11

[6] Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual[M]. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2006. 153-156.

[7] 徐平. 实验动物管理与使用操作技术规程[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 2007. 96-97.

[8] Van Keuren ML, Saunders TL. Rederivation of transgenic and gene-targeted m ice by embryo transfer [J]. Transgenic Res, 2004, 13(4):363-371.

[9] Glage S, Dorsch M, Hedrich HJ, et al. Rederivation of Helicobacter hepaticus-infected M ongolian gerbils by Caesarean section and cross-fostering to rats and m ice[J]. Lab Anim, 2007, 41(1):103-110.

[10] Luo C, Zuniga J, Edison E, et al. Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains[J]. J Am Assoc Lab Anim Sci, 2011, 50(4):471-478.

[11] Tarin JJ, Perez-Albala S, Cano A, et al. Stage of the estrous cycle at the time of pregnant mare’s serum gonadotropin injection affects the quality of ovulated oocytes in the mouse [J]. Mol Reprod Dev, 2002, 61(3):398-405.

Q95-33

B

1674-5817(2014)01-0056-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.012

2013-05-20

刘青青(1988-), 女, 硕士研究生, 研究方向: 转基因小鼠模型的建立, E-mail: lsjj619@126.com

薛智谋, 教授, 从事人类疾病动物模型的研究, E-mail:smcxzm@263.net