实验室自检在实验动物质量控制中的作用

2014-03-04关升起肖春兰周正宇

实验动物与比较医学 2014年1期

关键词：实验鼠病原体寄生虫

关升起, 肖春兰, 周正宇

(苏州大学实验动物中心, 苏州 215123)

实验室自检在实验动物质量控制中的作用

关升起, 肖春兰, 周正宇

(苏州大学实验动物中心, 苏州 215123)

目的对一年内在我校隔离检疫的不同来源的39批实验鼠进行病原体检测，分析各类疫病感染的规律，进一步完善隔离检疫系统。方法依照国家标准GB14922.2-2011和GB14922.1-2011进行检测,以细菌鉴定试剂盒法为补充。结果整体合格率为79.49%,其中来自国外动物检测合格率为100%(7批次来自美国，1批次来自日本);来源为国内共31个批次合格率为74.19%，其中病毒检出率为9.68%，致病菌检出率为25.81%，寄生虫检出率25.81%。结论国内来源动物背景复杂，质量有待提高。隔离检疫和实验自检室可有效阻止外来实验动物所携带病原微生物对动物设施可能带来的危害。

实验室自检; 隔离检疫; 检出率

随着功能基因组学、蛋白质组学、发育生物学等研究的深入，遗传修饰动物模型正受到越来越多的重视，各类转基因、基因敲除动物快速增加，已日渐成为现代生物医学研究的重要材料。目前国内已有诸多科研机构或企业提供商品化、个性化的遗传修饰动物模型制作服务。同时近年来留学回国学者，不仅带来了新的科研活力，也带来了许多遗传工程动物模型。这些新的模型的引入，对高校实验动物质量控制工作提出了更高的要求，传统的质量管理模式已很难适应现代高校实验动物质量控制的需要。鉴于此，我校自2012年8月建成动物隔离检疫室，并开展实验室病原体检测工作，现将结果报告如下:

1 材料与方法

1.1 实验动物

自2012年8月至2013年9月，共接收来自美国、日本, 及我国华南、华东、华北地区的16个单位39个批次的不同品系的SPF级实验鼠272只(雄鼠117只，雌鼠155只)，其中，基因工程小鼠221只，占总数的81.25%。8～10周龄SPF级ICR (作为基因工程小鼠的哨兵鼠)78只, 其中雄鼠32只,雌鼠46只。

1.2 主要试剂

中国药品生物制品检定所ELISA诊断试剂盒、梅里埃公司的API 20E鉴定试剂盒、API STAPH鉴定试剂盒、API 20 STREP 鉴定试剂盒、ID 32E鉴定试剂盒、ID STA PH鉴定试剂盒、A PI CORYNE鉴定试剂盒、API 20NE鉴定试剂盒、哥伦比亚血琼脂、北京陆桥生物科技公司的多种细菌培养基等。

1.3 方法

1.3.1 隔离检疫设施的设置与管理准备室: 门口设有挡鼠板。配置更衣柜、鞋架、消毒喷雾器。传递仓: 作为通过检疫动物及其饲养所需器具和材料的运输通道。隔离检疫室: 按照GB14925-2010中对无特定病原体级动物的要求设置和管理。另外，增设Ⅱ级生物安全柜1台，无菌隔离器1台，IVC 2台。隔离检疫室内(除动物尸体外)的一切物品出检疫室后均经121℃, 30 m in，高压灭菌。动物尸体按照国务院令第380 号《医疗废物管理条例》进行处理。无菌手术室: 与隔离检疫室相邻。设置的目的是在必要时将不符合实验动物微生物与寄生虫控制级别标准要求的实验动物进行净化升级。无菌净化室: 与无菌手术室相邻。设置目的是饲养净化得到的实验动物, 其设置与管理与隔离检疫室相同。

对隔离检疫期间的实验鼠进行动物行为学和临床症状观测，对表现出被毛杂乱、皮肤破溃、眼部炎性反应、口鼻粘膜潮红、耳部发绀、四肢运动失调、肛门红肿溃烂、体型消瘦、精神沉郁、步态失常、躁动不安等症状的小鼠，按照GB14922.2-2011(实验动物微生物学等级及检测)和GB14922.1-2011(实验动物寄生虫学等级及检测)的要求进行取样检测。

1.3.2 哨兵鼠检测法哨兵鼠为本中心自主繁育的4至6周龄ICR小鼠(繁育群小鼠的病原体检测每3个月一次，每年进行一次平行检测)。每个隔离品系放置哨兵鼠2只，隔离检疫鼠饲养1周后产生的脏垫料饲养哨兵鼠，饲养6周后，对哨兵鼠进行病原微生物和寄生虫检测。

1.3.3 病理剖检对哨兵鼠和有临床表现的隔离检疫期间的实验鼠进行剖检, 观察各组织器官的病变。

1.3.4 寄生虫检测透明胶带粘取法和刀片刮取皮层物取样法进行体外节肢寄生虫检测; ELISA法进行弓形虫检测: 直接涂片法检测蠕虫、肠道鞭毛虫和纤毛虫[1]。

1.3.5 病原菌和病毒的检测 ELISA法检测汉坦病毒、鼠痘病毒、小鼠肝炎病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠细小病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、支原体、泰泽病原体[1]; 使用梅里埃公司生产的ATB和API微生物系统及其配套的微生物鉴定试剂盒检测以沙门菌、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、鼠棒状杆菌、大肠埃希菌O115a，C， K(B)、嗜肺巴斯德杆菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、绿脓杆菌为主的550余种病原菌。其中，沙门菌、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、鼠棒状杆菌、大肠埃希菌O115a, C, K(B)、嗜肺巴斯德杆菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、绿脓杆菌属于假定存在病原, 这类菌按照国家标准GB14926.1-2011[1]中的要求进行分离培养后，用ATB和API微生物系统进行鉴定; 对于国家标准未明确要求检测的潜在病原菌采取伴随检测和取病灶于哥伦比亚血琼脂涂板，37℃培养24 h后，挑取可疑菌，哥伦比亚血琼脂纯培养后取样的方式进行细菌鉴定。

2 结果

2.1 病原微生物和寄生虫的检出情况

经检疫, 39个不同品系的实验鼠中, 8个品系检出国家标准要求为阴性的病毒2种、病原菌4种、寄生虫2种(表1)，从1个品系实验鼠中分离到1种未列入国家标准的人兽共患病病原菌， 5个品系实验鼠中检出对人致病，但未归入人兽共患病的病原菌5种，另有1个品系分离到1种具有新生化特性的潜在致病菌(表2)。

2.2 不同病原引发的症状和剖检特点

检出的病原体的临床与剖检特点(表3)。

3 讨论

高校目前仍然是我国实验动物生产及使用的主体之一，受体制等因素的影响，高校的实验动物质量隐患一直客观存在，不少高校尚未建立质量检测实验室[10]。同时，高校的实验动物设施具有使用人员多、人员流动性大、动物品种多等特点，质量控制也较其他单位难。根据1年来对来自国内高校或科研院所的11批次动物的隔离检疫，总体合格率为54.55%, 其中病原菌检出率为36.36%, 病毒为18.18%，寄生虫为54.55%。几种病原中，以鞭毛虫和螨虫感染为特点的寄生虫感染最为严重，而鞭毛虫的发病率最高，近半数隔离检疫鼠可检到鞭毛虫，其高发原因可能为: 1)外源引入病原体随实验动物入侵，若未设置专门的隔离检疫室而采取直接引入的方式，则可能造成感染; 2)人员带入高校动物设施进出人员多、课题杂，存在病原随实验人员在各实验室-动物设施-实验室间交叉传播的可能; 3)检测不力鞭毛虫属隐性感染，从动物行为学和症状上很难发现，因此，动物设施管理中若缺少定期检测机制，则可能造成鞭毛虫感染的扩大化; 4) 垫料或饲料消毒不彻底饲料垫料的消毒效果受很多方面的制约，肉眼难以判断，消毒效果的评估常常被忽视，这也使病原随饲料垫料带入成为了可能; 5) 环境消毒不充分高校动物设施满载或超载运行的方式较为常见，过高的饲养密度给环境消毒造成了困难，导致环境消毒不充分。

表1 39个批次实验小鼠的病原检测结果

表2 国家标准未做要求的对屏障系统具有威胁的病原微生物检出结果

表3 携带不同病原的小鼠的临床症状和剖检结果

隔离检疫主要针对境外引进或其他微生物背景不明的动物引进及使用，防止这些动物携带病原体引发感染。实践证明, 隔离检疫室的设立和正常运行可有效控制引进动物携带病原体入侵。在人才流动越加频繁的大环境下，实验动物随人才流动的情况越加频繁，病原体随实验动物流动的可能性也在逐渐增大，为了有效控制病原体的入侵, 及时发现并隔离患病动物，科研型高校设置隔离检疫室是必要的。此外，隔离检疫室的设立必然伴随着病原检测室的设立，其设立还可解决检测不利、饲料垫料消毒不彻底、环境消毒不彻底的问题，而一旦在动物设施中发现患病动物或疑似患病动物，即可采取隔离措施，进行病原微生物和寄生虫的检测，从而避免感染的扩大化，及早解决问题。

隔离检疫虽在一定程度上控制外来动物携带病原微生物的进入，但也面临一些亟待解决的问题。1) 隔离检疫工作中最感困惑的是检出了未被列入国家标准但却有致病性的病原体。以我校为例，曾检出类鼻疽假单胞菌，此菌不在国家标准要求不得检出的病原菌范围内，但相关文献却证明这种菌可能会危害人员健康，影响实验正常进行。为此，作者建议须不断加强国标的修订与完善。2) 细菌的致病性可能是变化的，有些非致病菌有变化为致病菌的可能，在我校检测过程中曾分离到具有强β-溶血特性的木糖葡萄球菌，该菌有可能是一种新的致病菌，在日后的工作中应该加强对其致病性的跟踪与观察。

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1674-5817(2014)01-0071-04