自噬在心力衰竭中的利弊评价——从自噬体到自噬流

王鹏博 综述 王国干 审校

(中国医学科学院，北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外心血管病医院，心血管疾病国家重点实验室，北京

100037)

心力衰竭是各种心脏病发展的终末期阶段。虽然血管紧张素转换酶抑制剂、β 受体阻滞剂和醛固酮受体拮抗剂等药物以及心脏再同步化治疗、植入型体内自动除颤器等器械治疗可在一定程度上改善心力衰竭患者的预后，但其5 年生存率仍只有50% 左右［1-2］。因此新的药物和治疗手段亟待出现，而这需要进一步阐明心力衰竭的发病机制。近年来多项研究表明自噬参与心力衰竭的发病过程［3-5］。然而自噬在其中的利弊仍存在争议，甚至相似的研究得出完全相反的结论［6-11］。产生这种争议的关键原因之一是自噬水平的评价方法不当。

1 自噬和自噬流的概念

自噬(autophagy)，顾名思义即“自己吃自己”，是细胞消化自身细胞器和内容物的一种生命现象。细胞可通过自噬，对受损的细胞器和异常的蛋白质等细胞内容物进行分解，并循环利用［12-13］。因此自噬系统相当于可将垃圾回收再利用的清洁系统。

自噬流(autophagy flux)即自噬的流程。由于自噬现象中最常见、研究最多的是巨自噬(macroautophagy)。因此目前研究中所提到的自噬流多指巨自噬的流程，即由内质网来源的膜包绕待降解物形成具有双层膜结构的自噬体(autophagosome)，继而与溶酶体融合，形成自噬溶酶体(autolysosome)并降解其内容物［14］。其中，自噬体的形成和清除是自噬流的两个密不可分的过程。

2 以自噬体为评价标准

由于自噬体是较具特征意义的自噬标志，因此既往研究多以自噬体有无或者多寡评价细胞自噬水平的高低。自噬体有无或者多寡的情况可以通过电镜下观察直接得到，也可以通过western-blot 等方法检测自噬体膜上的标记物蛋白LC3-Ⅱ或以绿色荧光蛋白标记LC3 等方法间接反映［15］。Shimomura 等［6］取27个扩张型心肌病的患者行部分左室切除术后的心肌，通过电镜发现变性的心肌细胞中存在包含线粒体等细胞器的自噬体，因此认为自噬是心肌细胞死亡的机制之一。而Kassiotis 等［7］通过对比9 个扩张型心肌病患者行左室辅助装置术前后心肌细胞内自噬和凋亡指标的变化，发现术后LC3-Ⅱ等自噬标记物明显下降，而凋亡指标变化不大，因而得出结论，自噬在心力衰竭中是一种适应(adaptive)机制。这两项研究均采用了人体心脏组织标本，只进行了观察，而没有直接干预自噬过程。从统计学中相关性和因果关系的角度来看，Shimomura 等［6］的研究结论是明显偏颇的，因为静态观察到变性心肌细胞中包含自噬体，只能说明自噬和心肌细胞死亡相关，却不能说明自噬是心肌细胞死亡的原因。譬如心力衰竭患者血液中脑钠肽(BNP)升高，只能说明BNP 和心力衰竭相关［16］，如果就此推论BNP 是心力衰竭原因，则在目前看来是显而易见的错误，因为BNP 具有抗心力衰竭作用［17］。而Kassiotis 等对心肌中的自噬进行了动态的观察，其研究结果具有重要意义，但结论似乎不妥，因为观察到心脏负荷减小后，心肌自噬标记物的降低，只能说明自噬标记物随心脏负荷的减小而降低，却不能说明自噬是心力衰竭的适应机制。这类似于动态观察心力衰竭患者血液中血管紧张素，心力衰竭改善后血管紧张素下降，只能说明血管紧张素随心力衰竭改善而降低，若认为血管紧张素升高是心力衰竭的适应机制，则是众所周知的谬误，因为目前公认心力衰竭中血管紧张素升高是机体适应不良(maladaptive)的表现，降低血管紧张素可治疗心力衰竭［18］。

由此可见，单纯通过直接或者间接观察心肌细胞中自噬体有无或者多寡来推论自噬和心力衰竭的因果关系，探讨自噬在心力衰竭中的利弊，是有失偏颇的。

由于人体试验的局限性，难以对自噬本身进行干预，因此有基础研究通过药物或者基因敲除的方法来调控自噬，以判断自噬在心力衰竭中的利弊。Atg5 是自噬体形成阶段中的重要因子。Nakai 等［8］通过抑制Atg5 调控自噬水平，观察小鼠心脏结构和功能的变化。当短时间抑制成年小鼠心脏中的Atg5 时，小鼠心肌细胞中代表自噬体数量的LC3-Ⅱ减少，心脏发生肥厚、左室扩大、收缩功能减低;而Atg5 基因敲除的小鼠，尽管心脏发育正常，但增加压力负荷一周后即出现LC3-Ⅱ减少、左室扩大和心功能不全。因此Nakai等［8］认为，基础水平的自噬对维护心脏结构和功能意义重大，心力衰竭时上调自噬水平可以保护心脏细胞免受血流动力学变化的损伤。但是当时多数研究认为自噬在压力负荷所致的心力衰竭中是适应不良的表现，自噬水平上调会加速病情进展，对机体是不利的［19］。Nakai 等的研究当时被认为是偏颇的。因为抑制Atg5 或者基因敲除Atg5 后，自噬被过度抑制，因此心力衰竭进展快，但这并不能说明上调自噬可以起保护作用;何况在心力衰竭患者中的自噬并没有受过度抑制［6］。那么，在保证基础水平自噬的前提下，上调自噬对心力衰竭是利还是弊?

Beclin1 是自噬启动阶段的一个关键因子。Zhu等［9］制作了beclin 1+/-的小鼠，这种小鼠心脏细胞具有基础水平的自噬，而不会像Nakai 等的研究中自噬被过度抑制。当压力负荷增加时，相对于野生型小鼠，beclin 1+/-小鼠心肌中绿色荧光蛋白标记的LC3 减少，左室扩大和收缩功能降低的幅度均减小。而当上调beclin-1 表达时，绿色荧光蛋白标记的LC3 增加，心脏结构和功能病理性恶化的程度加重。因此，作者得出结论，压力负荷增加会上调自噬，从而造成心力衰竭。

以上结论相反的两个研究，被一些研究者推论为:自噬是双刃剑，即基础水平的自噬对心力衰竭是有利的，但过度自噬则会造成病理性改变，使心力衰竭恶化［20］。然而这种推论是不妥的，因为Zhu 等［9］的研究结论并不十分可靠，其以绿色荧光蛋白标记的LC3 反映自噬体数量，并以此评价自噬水平是很可能导致谬误的。原因在于，自噬体数量的变化并不能反映自噬水平。自噬体数量增加并不能代表自噬水平上调。

3 以自噬流为评价标准

新近研究多以自噬流评价自噬水平［21-23］。自噬体的形成和清除是自噬流的两个密不可分的过程。从自噬流的角度来看，自噬体增多的原因既可能是自噬体的形成增加，也可能是其清除受阻。而这两种情况可代表自噬水平完全相反的状态:若只是自噬体的形成增加，则代表自噬流上调，自噬水平上调;若只是其清除受阻，则代表自噬流下调，自噬水平下调［24］。因此，不难理解，以自噬体有无或者数量多寡评价自噬利弊的研究会得出完全相反的结论。而以自噬流评价自噬水平则科学全面。

自噬流概念的引入，使众多研究从干预自噬体的形成过程转而关注自噬流的清除阶段。与上文Zhu等［9］研究类似的是，Ma 等［25］也观察到，当beclin-1 上调时，绿色荧光蛋白标记的LC3 增加，自噬体蓄积，心脏损伤加重。但与Zhu 等不同的是，Ma 等除了观察到自噬流上流的自噬体蓄积，还注意到其下流的自噬溶酶体并没有增加，因此认为心脏损伤的减轻并非自噬水平上调造成的，相反，是自噬清除功能障碍所致。而部分敲除beclin-1 时，自噬清除功能增强，心脏损伤减轻。另外，作者提出，蓄积的自噬体会增加活性氧，致使线粒体膜通透性增加，从而导致细胞死亡。由此可见，自噬体蓄积是导致病理性改变和细胞死亡的真正原因。之前认为自噬体蓄积是自噬过度表现的观点是错的。自噬体蓄积的原因很可能是自噬流在清除阶段出现功能障碍，这是自噬不足的一种表现。这一观点被其他的试验从另外的角度佐证。DNaseⅡ是溶酶体中的DNA 水解酶，在清除自噬体内的线粒体DNA 中起重要作用。Oka 等［26］发现DNaseⅡ对应基因敲除后的小鼠在基础水平并无异常，但当压力负荷增加时，其自噬体内的线粒体DNA 蓄积，从而引发心肌炎症和心力衰竭。新近Dutta 等［13］研究表明，上调自噬可以减少氧化应激反应对心肌细胞的损伤，而氧化应激反应参与心力衰竭的发生发展。可见自噬在心力衰竭的发生发展过程中起正面抗衡的作用，但当自噬功能在清除阶段受阻时，则蓄积的自噬体会导致病理改变。

如果将自噬系统比作可将垃圾回收再利用的清洁系统，那么线粒体DNA 等受损的细胞内容物好比垃圾，而自噬体是垃圾堆，清除过程相当于焚化。可见最终导致污染和破坏的是垃圾堆中的垃圾，而非清洁系统本身。根据垃圾堆的数量判断清洁系统的效率是不当的。因为垃圾堆的增多，既可能是清洁系统在前一阶段高运转，扫出了很多垃圾堆，也可能是清洁系统在清除阶段效率低下，扫出的垃圾堆焚化不良。因此，在评价自噬在心力衰竭中的利弊时，综合考虑其形成能力和清除能力是必要的。在尽量减少受损细胞器和异常蛋白的前提下，增强自噬的清除功能应是以后的研究热点和新药开发方向［11，27］。

综上所述，自噬在功能正常时可正面抗衡心力衰竭的进展，但当自噬清除功能障碍时，则会造成负面影响。如何提高心力衰竭中自噬的清除功能是以后的研究热点和新药开发方向。

［1］Jhund PS，Macintyre K，Simpson CR，et al.Long-term trends in first hospitalization for heart failure and subsequent survival between 1986 and 2003:a population study of 5.1 million people［J］.Circulation，2009，119(4):515-523.

［2］Felker GM，Thompson RE，Hare JM，et al.Underlying causes and long-term survival in patients with initially unexplained cardiomyopathy［J］.N Engl J Med，2000，342(15):1077-1084.

［3］Wang EY，Biala AK，Gordon JW，et al.Autophagy in the heart:too much of a good thing［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2012，60(2):110-117.

［4］Yang J，Carra S，Zhu WG，et al.The regulation of the autophagic network and its implications for human disease［J］.Int J Biol Sci，2013，9(10):1121-1133.

［5］Choi AM，Ryter SW，Levine B.Autophagy in human health and disease［J］.N Engl J Med，2013，368(7):651-662.

［6］Shimomura H，Terasaki F，Hayashi T，et al.Autophagic degeneration as a possible mechanism of myocardial cell death in dilated cardiomyopathy［J］.Jpn Circ J，2001，65(11):965-968.

［7］Kassiotis C，Ballal K，Wellnitz K，et al.Markers of autophagy are downregulated in failing human heart after mechanical unloading［J］.Circulation，2009，120(11 Suppl):S191-S197.

［8］Nakai A，Yamaguchi O，Takeda T，et al.The role of autophagy in cardiomyocytes in the basal state and in response to hemodynamic stress［J］.Nat Med，2007，13(5):619-624.

［9］Zhu H，Tannous P，Johnstone JL，et al.Cardiac autophagy is a maladaptive response to hemodynamic stress［J］.J Clin Invest，2007，117(7):1782-1793.

［10］Kim KH，Jeong YT，Oh H，et al.Autophagy deficiency leads to protection from obesity and insulin resistance by inducing Fgf21 as a mitokine［J］.Nat Med，2013，19(1):83-92.

［11］Shoji-Kawata S，Sumpter R，Leveno M，et al.Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide［J］.Nature，2013，494(7436):201-206.

［12］Gottlieb RA，Mentzer RJ.Autophagy:an affair of the heart［J］.Heart Fail Rev，2013，18(5):575-584.

［13］Dutta D，Xu J，Kim JS，et al.Upregulated autophagy protects cardiomyocytes from oxidative stress-induced toxicity［J］.Autophagy，2013，9(3):328-344.

［14］Rifki OF，Hill JA.Cardiac autophagy:good with the bad［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2012，60(3):248-252.

［15］Mizushima N，Yoshimori T，Levine B.Methods in mammalian autophagy research［J］.Cell，2010，140(3):313-326.

［16］Januzzi JL，van Kimmenade R，Lainchbury J，et al.NT-proBNP testing for diagnosis and short-term prognosis in acute destabilized heart failure:an international pooled analysis of 1 256 patients:the International Collaborative of NTproBNP Study［J］.Eur Heart J，2006，27(3):330-337.

［17］O'Connor CM，Starling RC，Hernandez AF，et al.Effect of nesiritide in patients with acute decompensated heart failure［J］.N Engl J Med，2011，365(1):32-43.

［18］Braunwald E，Bristow MR.Congestive heart failure:fifty years of progress［J］.Circulation，2000，102(20 Suppl 4):V14-V23.

［19］Rothermel BA，Hill JA.Autophagy in load-induced heart disease［J］.Circ Res，2008，103(12):1363-1369.

［20］Rotter D，Rothermel BA.Targets，trafficking，and timing of cardiac autophagy［J］.Pharmacol Res，2012，66(6):494-504.

［21］Lavandero S，Troncoso R，Rothermel BA，et al.Cardiovascular autophagy:concepts，controversies and perspectives［J］.Autophagy，2013，9(10):1455-1466.

［22］Klionsky DJ，Abdalla FC，Abeliovich H，et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy［J］.Autophagy，2012，8(4):445-544.

［23］Zhang Y，Xu X，Ren J.MTOR over activation and interrupted autophagy flux in obese hearts:a dicey assembly［J］.Autophagy，2013，9(6):939-941.

［24］Klionsky DJ，Abeliovich H，Agostinis P，et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes［J］.Autophagy，2008，4(2):151-175.

［25］Ma X，Liu H，Foyil SR，et al.Impaired autophagosome clearance contributes to cardiomyocyte death in ischemia/reperfusion injury［J］.Circulation，2012，125(25):3170-3181.

［26］Oka T，Hikoso S，Yamaguchi O，et al.Mitochondrial DNA that escapes from autophagy causes inflammation and heart failure［J］.Nature，2012，485(7397):251-255.

［27］Pastore N，Ballabio A，Brunetti-Pierri N.Autophagy master regulator TFEB induces clearance of toxic SERPINA1/alpha-1-antitrypsin polymers［J］.Autophagy，2013，9(7):1094-1096.