吖啶类荧光探针与蛋白质相互作用的研究

张丽娟，张 欣

吖啶类荧光探针与蛋白质相互作用的研究

张丽娟，张 欣

（福建生物工程职业技术学院药学系，福建福州350002）

文章研究3种新型吖啶类荧光探针（N-（2-二甲氨基）乙基-9-氯吖啶-4-甲酰胺（NCAF）、9-[（N-2-二甲氨乙基）吖啶-4-甲酰胺]-α-丙氨酸（NAFA）和4,9-二[N-（2-二甲氨基）乙基]-9-吖啶胺-4-甲酰胺（DNAF））与牛血清白蛋白（BSA）的相互结合作用机理。分别对3种吖啶类探针自聚集情况、与牛血清白蛋白结合常数KA和结合位点数n、热力学参数H、G以及S、能量转移效率E和结合距离R0进行比较，并对实验数据进行分析。研究了3种吖啶类探针对蛋白质内源荧光猝灭的猝灭机制和主要作用力类型，为进一步研究新的生物探针及其在生物大分子识别分析应用提供了一定的实验和理论支持。

吖啶类荧光探针；蛋白质；相互作用

目前，研究蛋白质分子探针是生物化学中的热点之一。吖啶类衍生物具有良好的发光效应，是一类很有前途的生物探针。吖啶-4-甲酰胺衍生物探针在国内外的应用研究较少，开展这方面的研究对于拓展吖啶类荧光探针的应用范围，开发性能更优良的生物大分子荧光探针具有重要意义。以下是3种新合成的吖啶类荧光染料探针，以4-羧基吖啶酮为母体，在4位上引入N-（2-二甲氨基）乙基，合成了N-（2-二甲氨基）乙基-9-氯吖啶-4-甲酰胺（NCAF），结构简单，具有3个平面六元环共轭结构；在此基础上，通过在9位上引入支链α-丙氨酸，合成了9-[（N-2-二甲氨乙基）吖啶-4-甲酰胺]-α-丙氨酸（NAFA），大大改善了吖啶类化合物与生物大分子的亲和性；通过在9位上引入N-（2-二甲氨基）乙基，合成了4,9-二[N-（2-二甲氨基）乙基]-9-吖啶胺-4-甲酰胺（DNAF），强化分子正电性，且不受体系酸度影响[1]。本文基于吖啶类探针的良好生物活性和发光性能，在新型吖啶类探针与牛血清白蛋白（简写BSA）相互作用方面进行研究探索。

1 仪器与试剂

Varian Cary Eclipse荧光光谱仪（美国VARIAN）；Perkin-Elmer Lambda 800紫外-可见分光光度计（美国）；PHS-3C型酸度计（上海大普仪器有限公司）。

NCAF由实验室自制，配成3.0×10-4mol·L-1的储备液（水∶CH2Cl2∶CH3OH=98∶1∶1），4℃条件下避光保存；NAFA（实验室自制，配成1.5×10-4mol· L-1储备液，4℃条件下避光保存）；DNAF（实验室自制，配成3.0×10-4mol·L-1储备液，4℃条件下避光保存）；牛血清白蛋白（BSA）（Sanland-chem Internation Inc.配成含0.1mol·L-1NaCl的1.0×10-4mol·L-1储备液，保存于4℃避光条件下）；Tris-HCl缓冲溶液（pH值为7.0）；所用试剂均为生化纯与分析纯，实验用水均为二次去离子水。

2 实验方法

在一系列5mL刻度试管中加入pH值为7.0的Tris-HCl缓冲溶液2.0mL，0.5mLBSA（1.0×10-4mol· L-1）溶液，不同体积的NCAF（3.0×10-4mol·L-1）溶液，用水稀释至刻度，摇匀，分别在不同温度下，测定BSA的荧光光谱，激发波长280nm，发射波长290～500nm，狭缝宽度均为5nm。同理NAFA和DNAF分别用上述同样方法测定BSA的荧光光谱。

3 结果与讨论

3.1 NCAF、NAFA、DNAF三者光谱性质与自聚集情况比较

图1为NCAF、NAFA、DNAF 3种荧光染料探针的荧光发射光谱比较。

图1 NCAF、NAFA、DNAF的荧光发射光谱Fig.1 The fluorescence emission spectra of NCAF and NAFA and DNAF.

由图1可以看出，随着9位上α-丙氨酸或N-（2-二甲氨基）乙基侧链基团的引入，吖啶-4-甲酰胺衍生物的荧光量子产率得以提高，表现为相同浓度下的荧光强度的大幅提升，推测这是环外氨基上的电子激发转移到环上，由于它们的孤对电子的电子云几乎与芳环上的π轨道成平行，因而实际上它们共享了共轭π电子结构，扩大了其共轭体系，因此，荧光效率也提高许多。而修饰N-（2-二甲氨基）乙基的效果要远好于β-丙氨酸，这是N-（2-二甲氨基）乙基较强的供电子作用所致；另一方面，由于α-丙氨酸连接有-COOH，这类取代基主要以吸电子作用为主，可能导致芳环共享共轭π键或扩大的共轭π键的电子云密度降低，因此荧光强度受到一定削弱[2]。

表1 NCAF、NAFA、DNAF发生自聚集猝灭的浓度Tab.1 Concentration of fluorescence self-quenching for NCAF and NAFA and DNAF

图1的荧光光谱及表1荧光体聚集自猝灭情况比较显示，从NCAF，NAFA到DNAF，发生二聚体自聚集荧光猝灭的染料浓度逐渐增大，这是由于染料表面电荷排斥力和侧链基团空间位阻加大，使发生自聚集的可能性下降的缘故。同时，NCAF的二聚体荧光峰波长小于单体荧光峰波长，而NAFA与DNAF的二聚体荧光峰波长大于单体荧光峰波长，推测也是由于侧链基团空间位阻加大，倾向于形成头对头的J-聚集形态，而非面对面的H-聚集形态。

3.2 NCAF、NAFA、DNAF三者结合常数与结合位点数比较

图2为牛血清白蛋白溶液体系中，随着NCAF浓度的增加，BSA的荧光猝灭谱图。343nm左右为BSA的荧光猝灭情况，455nm处为在BSA作用下的不同浓度的NCAF的荧光增强情况。

λex=280nm,狭缝宽度5 nm,pH=7.0,T=288K.

由图2得到的343nm处的实验数据进一步应用式log[（F0-F）/F]=logKA+nlog[Q][3]（1）处理，得到图3，在NCAF由低到高的整个浓度范围都呈现良好的线性，其相关系数R2=0.9983，与式（1）吻合良好，表明这一过程属于静态猝灭过程。由所得的直线求算出NCAF与BSA结合时的结合常数Ka=9.81× 104，结合位点数n=1.15。可见NCAF与BSA可发生相互作用，且结合作用较强。

图3 log[（F0-F）/F]对log[Q]作图Fig.3 The plot of log[（F0-F）/F]versus log[Q]

用同样方法求出NAFA和DNAF与BSA的结合常数与结合位点数，结果得表2。

表2 NCAF，NAFA，DNAF结合常数与结合位点数比较Tab.2 Comparisons of equilibrium constants and numbers of binding sites for NCAF and NAFA and DNAF

从表2可知，从NCAF，NAFA到DNAF，结合常数和结合位点数逐渐下降，说明与BSA的主要发色基团第212位的色氨酸残基的结合能力逐渐减弱。由于该色氨酸残基位于BSA疏水空腔中，据此推测由于从NCAF，NAFA到DNAF亲水性逐步提高以及空间位阻逐步加大，进入BSA疏水空间的几率下降。

3.3 NCAF、NAFA、DNAF与BSA主要结合力比较

当温度变化不大时，反应焓变可以看作是一个常数，根据ln（KA2/KA1）=（1/T1-1/T2）ΔH/R；ΔG= -RTlnKA=ΔH-TΔS；可求出24℃时焓变ΔH（kJ· mol-1）、熵变ΔS（J·mol-1·K-1）、反应自由能变ΔG（kJ·mol-1）。由于ΔH和ΔS，根据热力学参数与作用力的关系，可知探针与BSA结合的作用力类型。

表3是NCAF，NAFA和DNAF主要热力学参数与结合力比较。

表3 NCAF、NAFA、DNAF主要热力学参数与结合力比较Tab.3 Comparisons of equilibrium constants and numbers of binding sites for NCAF and NAFA and DNAF

表3结果与三者的结合常数和结合位点数比较结果相一致，证实随着吖啶-4-甲酰胺衍生物的侧链基团分子量的加大，与BSA的结合作用减弱。

3.4 NCAF、NAFA、DNAF三者与BSA能量转移效率和结合距离比较

研究表明，生物大分子与药物、染料等的结合通常遵循Frster非辐射能量转移机制。根据Frster非辐射能量转移理论，可以求得染料与生物大分子中产生荧光基团之间的结合距离。

图4为BSA与NCAF物质的量之比为1∶1时，体系的吸收谱和相同浓度的BSA的荧光发射谱的光谱图。

图4 NCAF与BSA的荧光发射光谱与紫外吸收光谱的谱图重叠Fig.4 Overlap of the fluorescence emission spectra（1）and absorption spectra（2）NCAF∶BSA=1∶1,[BSA]=1.0×10-5mol·L-1, [NCAF]=1.0×10-5mol·L-1

由图4可见，BSA的吸收光谱与发射光谱有相当重叠面积，因此，初步判定为遵循Frster非辐射能量转移机制。根据Frster非辐射能量转移理论进行数据处理，积分求得图4重叠图中光谱重叠部分（285～500nm）的面积积分J=2.07×10-13cm3·L· mol-1。BSA分子中在134和2l2位处有2个色氨酸残基，BSA的荧光（λex=280nm,λem=335nm）主要来自于第212位的色氨酸残基。根据文献，在上述条件下，偶极空间取向因子K2可取受供能体各向随机分布的平均值2/3，供能体荧光量子产率Φ通常取蛋白质中色氨酸的量子产率0.118，介质折射指数N一般取水和有机物折射指数的平均值1.336[4]。将以上各量及各步计算结果依次代入式R6=8.8×10-250K2N-4φJ、log（[F0-F）/F]=logKA+nlog[Q]、E=1-F/F0和E=+r6）求得临界距离R0=4.06 nm，能量转移效率E=0.34，BSA中第212位色氨酸残基与NCAF分子间的距离r=4.54nm。

按照上述方法求得NAFA和DNAF能量转移效率和结合距离，结果见表4。

表4 NCAF、NAFA、DNAF能量转移效率和结合距离比较Tab.4 Comparisons of the transfer efficiency of energy and distance between acceptor and obtained for NCAF and NAFA and DNAF

由表4结果表明，3种吖啶-4-酰胺衍生物与BSA的相互作用均符合非辐射能量转移的Frster共振机理，但从NCAF，NAFA到DNAF，染料与BSA间的能量转移效率逐渐降低。

4 结论

利用紫外光谱、荧光等技术研究了合成的新型探针与蛋白质之间的相互作用。NCAF、NAFA、DNAF 3种荧光染料探针的荧光量子效率逐渐提高。测定了吖啶类探针与BSA的热力学参数、结合位点数、表观结合常数和供体-受体作用距离，确定了探针与蛋白质分子之间的作用机制均为静态猝灭机制，而疏水相互作用、静电吸引力、氢键和范德华力分别对3种吖啶类荧光探针与BSA的结合起到重要作用。分别对3种吖啶类探针与蛋白质相互作用进行比较，为进一步开展探针的测定应用提供理论支持。

［1］张丽娟.吖啶-4-甲酰胺衍生物的合成与表征［J］.广州化工, 2011,39（15）:117-118.

［2］陈国珍，黄贤智，许金钩，等.荧光分析法［M］.北京:科学出版社，1990.43-44.

［3］冯喜增，白春礼，林璋，等.吖啶橙与牛血清白蛋白的相互结合反应［J］.分析化学，1998，26（2）:154-157.

［4］YANG Ping,YANG Man man,YANG Bin sheng.Fluorescence enhancement effect and the interaction between donor and acceptor［J］.Chinese J.Chem.,1996,14（2）:109-113.

表2 实际样品的测定结果Tab.2 Determined results of the sample

通过换算该样品中异氰酸根平均含量为13.8%，样品利用GB13941-1992二正丁胺法滴定结果异氰酸根含量为14.7%，两种方法的结果相差较小。结果表明，本方法相对偏差小于3%，准确性较好，相对标准偏差小于5%，方法的稳定性较好，可满足实际样品检测的需要。

3 结论

研究表明，通过对试样进行乙醇衍生，利用高效液相色谱仪对相应的衍生物分离并检测，能够得到目标产物MDI及中间产物的浓度，为MDC催化热分解制备MDI反应过程的转化率及选择性提供依据，该方法具有操作简便、灵敏、快速且环境友好等特点，能满足实验的要求。

参考文献

［1］钱伯章.异氰酸酯的国内外市场分析［J］.石油和化工经济分析，2005，（21）：35-41.

［2］王公应，陈东，冯秀丽，等.一种用于二苯甲烷二氨基甲酸酯分解制备二苯甲烷二异氰酸酯的超细氧化物催化剂：CN：1721060A［P］.2006-0l-18.

［3］陈为都，王小妹，黄仲立.IPDI及MDI型聚氨酯预聚体中游离二异氰酸酯含量测定［J］.聚氨酯工业，2009，24（2）：43-46.

Research on the interaction between acridine fluorescence probes and protein

ZHANG Li-juan，ZHANG Xin
（Department of Pharmacy，Fujian Vocational and Technical Institute of Biological Engineering,Fuzhou 350002,China）

The paper aims to research on the mechanisms of binding and interaction between 3 new types of acridine fluorescence probes,namely,NCAF,NAFA&DNAF and bovine serum albumin（BSA）.It compared the 3 types of acridine fluorescence probes one another in terms of self-aggregation,constant of binding with BSA（KA）, number of binding sites（n）,thermodynamic parameters△H,△G and△S,energy conversion efficiency（E）and binding distance R0,and analyzed all the experiment data.It researched on both of quenching system against the quenching of protein intrinsic fluorescence and type of primary action force for the said 3 types of acridine fluorescence probes，and thus provides certain experimental and theoretical support for further researching on new biological probes and their application to identifying and analyzing large biological molecules.

acridine fluorescence probes；protein；interaction

O657

A

1002-1124（2014）08-0075-04

2014-07-14

张丽娟（1977-），女，福建福州市人，讲师，毕业于河北科技大学，本科，现为福州大学制药工程在读硕士研究生，并从事化学教学和研究工作。