没食子对口腔细菌生物膜中细菌代谢的作用研究

冯锦虹， 李新尚， 牛巧丽， 赵 今

(新疆医科大学第一附属医院口腔医学中心， 新疆维吾尔自治区口腔医学研究所， 乌鲁木齐 830054)

现代龋病病因学认为,牙菌斑是典型的生物膜结构,是龋病发生的始动因子。口腔中牙菌斑生物膜是由多种微生物在牙面上沉积的有机基质中互相集聚、交联而形成的生态结构，生物膜中各微生物相互依存，相互竞争，构成了复杂的生态关系。糖代谢是细菌致龋的重要环节，是龋病发生的毒力因素之一。蔗糖是葡萄糖基转移酶(GTF)唯一的底物，GTF对蔗糖具有高度特异性，只能催化蔗糖的葡糖基部分，以一定形式的糖苷键相连而成为葡聚糖，对葡萄糖或其他双糖或多糖的葡糖基没有催化聚合作用。GTF是非水溶性葡聚糖产生的关键酶，因此需要研究药物对 GTF活性的影响，才能说明药物对细菌生物膜代谢的作用机制。本研究通过观察没食子鞣质及其有效提取物作用下细菌生物膜中GTF的变化，了解 没食子鞣质及其有效提取物对口腔细菌生物膜中GTF活性的影响。

1 材料与方法

1.1实验菌株变形链球菌 (Streptococcus mutans ATCC 25175)、血链球菌 (Streptococcus sanguis ATCC 10556)、 粘性放线菌 (Actinomyces viscosus ATCC 19246)、乳酸杆菌 (Lactobacillus rhamnosus AC 4130)由口腔生物医学工程教育部重点实验室提供。

1.2菌悬液的发酵罐培养条件温度：37℃由循环水浴箱维持； 搅拌：低速，由磁力搅拌器控制，以使发酵罐中菌悬液混匀； 厌氧环境：95% N2，5% CO2，流速10 mL/min，由蠕动泵控制； pH：用0.1 M NaOH溶液维持在7.0左右，由pH控制仪与蠕动泵调节； 清除率：D=0.1/h，由蠕动泵控制。4种实验菌株在体外培养及鉴定:将配制浓度为1.0 MFarland的4种实验菌菌悬液、BHI培养基、粘性放线菌和乳杆菌的菌悬液加入发酵罐中连续培养2 d，加入变形链球菌和血链球菌的菌悬液培养2～3 d，当发酵罐中的混合菌培养达到稳定之后用蠕动泵将混合菌悬液泵出，比浊调整菌悬液浓度为1.0 MFarland使用。

1.3没食子和有效提取物药液的制备及实验分组实验药物为没食子鞣质和有效提取物(没食子酸+没食子酸甲酯)，药物及药物浓度的选择根据药物对口腔细菌的生长实验结果确定[1-2]，没食子鞣质和有效提取物(没食子酸+没食子酸甲酯)为4 mg/mL。先用蒸馏水将药物配制成64 mg/mL的母药液放置冰箱(4℃)备用。使用时将母药液按2倍稀释法溶于BHI液体培养基中形成BHI药液培养基。实验分为阴性对照组(空白组)，阳性对照组(为没有干预处理形成的细菌生物膜)、没食子鞣质组和有效提取物(没食子酸+没食子酸甲酯)组。 每组6个平行样本。

1.4试剂与仪器YZ1515型单通道蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司)，pH控制仪(Jenco，上海任氏电子有限公司)，HX-1050型循环水浴箱(北京博医康技术公司)， 培养罐(continuous culture vessel，四川大学玻璃仪器制造厂)，CJJ-781型磁力加热搅拌器(江苏金坛振兴仪器厂)，恒温培养箱(上海浦东跃欣科学仪器厂)，标准24孔细胞培养皿(Corning Incorporated)， CrystalTMSpecTM比浊仪(美国 Becton Dickinson and Company)，HTS 7000 PLUS型多孔板(荧光/紫外光)高效分析仪(美国PERKIN ELMER)，超滤离心管(NanosepR Device OD030C33 Pall Life Sciences U.S.)，标准96孔微量板(Corning Incorporated CostorR3599 )。 固体硫酸铵，0.01 mol/L pH 6.0的磷酸盐缓冲液，0.24 mol/L HCl，0.2 mol/L pH 6.4的磷酸盐缓冲液。溶液A：纯酒石酸钠12 g，无水碳酸钠24 g，加水250 mL，混匀后缓慢加入10%硫酸铜溶液40 mL和碳酸氢钠16 g。500 mL热蒸馏水加入无水硫酸铵180 g，煮沸去除气体后冷却。2种液体混合定容至1.0 L。溶液B(钠尔逊显色剂)：钼酸钠25 g溶于450 mL蒸馏水，缓慢加入浓硫酸21 mL。3 g砷酸氢二钠溶到25 mL蒸馏水中，再缓慢注入上述溶液中，完全混合，37℃放置24～48 h，溶液变黄后移至棕色瓶保存。葡萄糖标准液：100 mg/L。

1.5粗酶提取液的制备用于细胞培养直径15 mm无菌盖玻片放入24孔细胞培养皿中，每孔加入菌悬液500 μL、BHI培养基1 500 μL、80% N2、20% CO2，37℃下厌氧培养12 h时更换1 500 μL新鲜培养基，形成24 h细菌生物膜，去除孔内培养基，PBS洗孔及玻片2次去除表面浮游细菌，加入药液培养基(2 000 μL/孔)。对照组加入BHI 液体培养基，每组6个平行样，80% N2、20% CO2，37℃下厌氧培养18～20 h，吸出孔内培养基放入离心管内，PBS缓冲液1 000 μL/孔洗孔2次，与离心管内液体和并，3 000 r/min 离心30 min，上清液中加入固体硫酸铵达60%饱和度，放入4℃冰箱24 h，15 000 r/min离心30 min ，弃去上清液，将沉淀物用5 mL含0.01%NaN3的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液溶解，放入超滤离心管内，10 000 r/min 离心15 min，弃去管底水，滤膜上的沉淀用相同缓冲液溶解后再离心5～10 min，收集滤膜管内粗酶提取液进行酶活性测定。重复2次实验。

1.6各组酶活性的测定(1)酶底物反应：排管6支，每支管内加入粗酶提取物200 μL，取0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)1 mL、0.5 mol/L蔗糖1 mL、双蒸水4 mL混匀，在所有管加入三合一试剂300 μL，37℃(200 r/min)孵育1 h，加入0.24 mol/L HCl(50 μL/管)终止反应，加入双蒸水1 250 μL混匀，3 000 r/min离心5 min，取上清液测定还原糖。(2)用标准96孔微量板，荧光(485/535)进行板扫描，确定孔板的中心位置，在HTS700Plus上编制检测程序：波长为635 nm，每孔读取4个点的均值，做盘图设计。(3)测定还原糖：排管2组，用12通道加样枪及配套加样头，按盘图位置，分别在标准曲线管加入0、50、100、150、200 μL葡萄糖标准液(0.1 mg/mL),双蒸水250、200、150、100、50、0 μL补足。上清液样本250 μL。在所有管中加入A溶液250 μL，摇匀，沸水煮浴20 min，冰水冷却后每管加入B溶液250 μL，加入双蒸水2 mL，摇匀。(4)用12通道加样枪及配套加样头，吸取糖测定液300 μL加入96孔微量板相应孔中，按所编制检测程序在HTS700Plus上测量。HTS700Plus自动用635 nm波长读数，并自动换算出样本GTF还原糖含量。(5)将含量导入Excel，用每个样本除以该样本的蛋白含量即得到该样本每 mg 胞外GTF蛋白所还原的糖含量。GTF活力计算：还原葡萄糖量/198.17(葡萄糖分子量)/60。

1.7统计学处理采用SPSS17.0软件包对GTF活性进行分析，实验药物对酶活性抑制率进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

空白组、阳性对照组、没食子鞣质组及有效提取物组24 h细菌生物膜GTF 的活性分别为(0.003 2±0.022)、(0.660 1±0.204)、(0.018 6±0.077)、(0.052 7±0.035)。口腔细菌组成的24 h的细菌生物膜经没食子鞣质和有效提取物所选定的实验浓度作用后，没食子鞣质组GTF活性为(0.018 6±0.077)，有效提取物组GTF 活性为(0.052 7±0.035)，2个实验组GTF的活性受到明显抑制，与阳性对照组GTF活性相比差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

龋病是人类最常见的口腔疾病，发病率高，严重影响人类的口腔健康和全身健康。牙菌斑生物膜是口腔细菌致病的重要微生态环境，生物膜中各微生物相互依存，相互竞争，构成了复杂的生态关系。大量的研究表明生物膜中细菌的抗药性及各种生化代谢效率均显著高于体外培养游离细菌[3-4]。生物膜对宿主防御系统有较强的抵抗力，耐受性强，对抗生素敏感性下降，具有空间和环境的多样性、能表达不同于浮游细菌的表型、抵抗水流的冲刷等特点。因此，关于药物对细菌生物膜相关疾病的研究需要从药物对细菌生物膜的形成、生物膜细菌组成与代谢、生物膜形态结构、生物膜的胞外基质的影响等方面进行深入研究，才能阐明药物对生物膜的作用机制。

牙菌斑生物膜内部存在着复杂的代谢活动，其中糖代谢是细菌致龋的重要环节，非水溶性葡聚糖的产生在形成生物膜过程中起着重要作用[5]。参与菌斑基质的组成，促进细菌的粘附、聚集，加速菌斑的形成。水不溶性胞外多糖还具有生物屏障作用，使菌斑内外各种物质的出入受到限制；使菌斑内细菌代谢产物如有机酸等不易扩散，造成釉质表面局部pH值下降，是龋病发生的毒力因素之一。GTF对蔗糖具有高度特异性，GTF在分子结构上可大致分为2个相对独立的功能区：1个是位于氨基端约2/3肽段的催化区，结合并裂解蔗糖；1个是位于羧基端约1/3肽段的葡聚糖结合区，提供结合葡聚糖的受体。GTF催化蔗糖合成葡聚糖分为2个连续的过程：蔗糖水解成果糖和葡萄糖，将葡糖基转移到多糖链上合成葡聚糖，其活性决定细菌代谢终产物的生成，因此通过抑制GTF的活性能抑制牙菌斑基质的形成，从而达到防龋的目的。从本实验结果可以看出经没食子鞣质及其有效提取物所选定的实验浓度作用后，口腔细菌组成的24 h细菌生物膜GTF的活性受到明显抑制，与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。鞣质具有强烈的抑制变形链球菌GTF的作用，其中具有5～6个倍酰基的penta galloyl glucose(黄倍酰单宁)和hexagalloyl glucose，在1 mmol/L浓度即显示出了近100% 的抑制活性，甚至强于洗必泰[6]。对植物多酚的研究也证实，随着聚合程度的增加，乌龙茶中多酚类物质对变形链球菌的GTF的抑制活性增加[7]。 吴永生等[8]研究发现五倍子多酚性化合物对GTF具有明显的抑制作用。

有研究表明没食子鞣质对浮游状态及生物膜状态下的GTF酶活性抑制差异显著[9]。目前对此差异的原因尚不清楚，可能是生物膜状态的细菌启动了一套与浮游状态不同的基因表达形式，从而GTFB、GTFC、GTFD 基因的表达发生改变，与药物敏感性有直接关系。Koo等[10]报道显示芹菜素可以抑制葡萄糖基转移酶的活性，并能显著降低GTFB 和GTFC 的表达，相反增加GTFD 的表达。本课题组后续研究还将在mRNA水平研究实验药物对口腔细菌生物膜状态GTF基因表达的差异，进一步探讨天然药物防龋的作用机制。

参考文献：

[1] 赵今，李继遥，周学东，等. 口腔多菌生物膜对防龋中药敏感性的实验研究[J]. 华西口腔医学杂志，2006，24(6)：546-550.

[2] 赵今，朱昞，周学东，等. 五倍子不同组分对口腔细菌生物膜的清除效应[J].实用口腔医学杂志，2007，23(1)：23-27.

[3] Mayer C, Moritz R, Kirschnner C, et al. The role of intermolecular interactions:studies on model systems for bacterial biofilms [J]. Int J Biol Macromol, 1999, 26(1):3-16.

[4] Mark D, Fischer W, Krokotsch A, et al. The intercellular adhesin involved in biofilm accumulation of staphyloccus purification and structural analysis [J]. J Bacteriol, 1996, 178(1):175-183.

[5] 赵今，孙玉亮，牛巧丽，等.没食子鞣质及有效提取物对致龋细菌代谢的作用[J].新疆医科大学学报，2009，32(1)：3-6.

[6] Hsieh TJ, Liu TZ, Chia YC, et al. Protective effect of methyl gallate from Toona sinensis (Meliaceae) against hydrogen peroxide-induced oxidative stress and DNA damage in MDCK cells [J]. Food Chem Toxicol，2004, 42(5):843-850.

[7] Sasaki H, matsumot M, Tamaka T, et al. Antibacterial activity of polyphenol components in onlong tea extract against Streptococcus mutans[J]. Caries Res 2004, 38(1):2-8.

[8] 吴水生，施红，张小如，等. 中药复方药效学研究中应重视多靶点作用的意义[J]. 中国中西医结合杂志，2001，21(7)：545 - 546.

[9] 林静，赵今，朱明，等. 没食子鞣质联合氟化钠对不同状态变形链球菌葡萄糖及转移酶活性的影响[J]. 中华老年口腔医学杂志，2010，8(5)：264 - 267.

[10] Koo H, Xiao J, Klein MI, et al. Exopolysaccharides Produced by Streptococcus mutans Glucosyltransferases Modulate the Establishment of Microcolonies within Multispecies Biofilms[J]. J Bacteriol,2010,192(12):3024-3032.