血管生成素样蛋白4在肿瘤生长与转移中的作用研究进展

郑茜文 综述，毛熙光 审校

肿瘤的发生、发展、分化、侵袭与转移是多因子作用的结果，肿瘤的侵袭与转移是导致患者死亡的主要原因。新生血管形成在肿瘤侵袭和转移过程中起关键作用，血管生成素样蛋白4（angiopoietin-like protein 4,ANGPTL4）是新发现的一种分泌型蛋白，它与血管生成、脂类代谢和葡萄糖代谢密切相关，是血管生成素样蛋白（angiopoietin-like proteins,ANGPTLs）家族的一个成员。该家族包括7个蛋白，分别命名为血管生成素样蛋白1～7。它们拥有和血管生成素（angiopoietins,Angs）家族类似的结构，其分别在炎症、代谢及肿瘤生长和转移中发挥着不同的作用［1］。本文就ANGPTL4 的生物学特性、其在肿瘤生长、转移中的可能作用以及潜在的临床应用价值做一综述。

1 ANGPTL4的生物学特性

1.1 ANGPTL4 的结构特点 在2000 年，Kim 等［2］首先采用RACE 技术从人胎盘cDNA 文库中分离出了一个新基因，该基因的mRNA 在肝脏中呈特异性高表达，后来该基因被命名为血管生成素样蛋白4（ANGPTL4）。人的ANGPTL4 基因定位在19p13.3，

有7 个外显子和6 个内含子，基因cDNA 全长为1943bp，开放阅读框含1218bp，编码406个氨基酸，预计分子量为45.2kDa［3］。ANGPTL4 结构特点为存在一个高度疏水的信号肽，氨基端为一个螺旋卷曲结构域，羧基端为一个大的血管生成素类纤维蛋白原。该羧基端的结构域在Angs和ANGPTLs家族普遍存在。

1.2 ANGPTL4的功能 天然全长的ANGPTL4以二聚体或者四聚体复合物的形式存在，但可通过蛋白水解过程生成氨基端卷曲的螺旋片段ANGPTL4（nANGPTL4）和羧基端类纤维蛋白结构域ANGPTL4（cANGPTL4）［4］。Lei等［4］采用肝癌细胞系Huh7来观察ANGPTL4 的水解过程，发现ANGPTL4 的水解过程由前蛋白转化酶（proproteinconvertases,PC）介导，进一步研究还发现前角蛋白转化酶家族中的多个因子当作用于肝癌细胞系Huh7 时，结果均显示ANGPTL4 的断裂位点为-RRXR-处［4］，但其具体水解断裂的机制尚不清楚。

研究发现，全长的ANGPTL4 能通过结合硫酸乙酰肝素蛋白多糖抑制因缺血缺氧损伤的周围血管内皮细胞的迁移和脉管的形成［5］，而水解分裂后的nANGPTL4 则通过与脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase,LPL）的结合来抑制ANGPTL4s低聚体的活性［6］，水解分裂后的cANGPTL4 片段则可以结合并激活整合素β1和β5，通过FAK/PAK信号通路来调节角化细胞迁移［7］。另一项研究还发现cANGPTL4 通过结合并激活整合素α5β1 介导的Rac1/PAK 信号通路减弱细胞与细胞间的联系，随后cANGPTL4 与内皮细胞钙粘蛋白和claudin-5结合并作用于血管内皮细胞连接处，破坏血管内皮细胞屏障功能［8］。这些功能在肿瘤的发生发展中有着重要的作用。由于ANGPTL4 及其水解片段功能的多样性，使得它在肿瘤中的作用机制十分复杂，尤其羧基端类纤维蛋白原区域是肿瘤发生过程中一个重要的调节子，但全长的ANGPTL4 和nANGPTL4 能否通过直接刺激细胞内信号来影响肿瘤的发生发展目前尚不清楚。

2 ANGPTL4与肿瘤

近年来，通过研究ANGPTL4 在人体肿瘤中的表达和转录调节，揭示了ANGPTL4在炎症和缺氧环境下对肿瘤生长的影响，以及血管新生在侵袭和转移中的重要作用。

2.1 ANGPTL4与肿瘤的生长

2.1.1 炎症条件下 越来越多的证据表明炎症在肿瘤发生发展过程中具有促进肿瘤生长的作用。肿瘤的微环境和创口的微环境十分相似，包括大量的生长因子和促炎症反应脂质介导子，如前列腺素类［9］。环氧化物酶-2（cyclooxygenase type2,COX-2）是一种限速酶，它把花生四烯酸转化成前列腺素类化合物。在炎症中，COX-2 的表达被激活的巨噬细胞上调，这一过程可增加前列腺素类化合物的合成，从而调节多种免疫细胞的行为［10］。Kim 等［11］研究发现COX-2 的表达在近50%的结直肠腺瘤和85%的结直肠腺癌中被提高，而结直肠癌中发现最丰富的前列腺素E2（prostaglandinE2,PGE2）和COX-2 的肿瘤促进功能密切相关。该研究显示了PGE2 和缺氧在促进结直肠癌细胞增殖中具有协同作用，共同增强ANGPTL4表达和cANGPTL4 分泌，并发现cANGPTL4 导致了活体外和活体内的结直肠癌细胞异常增殖。究其原因，可能是cANGPTL4 诱导了NADPH 氧化酶介导的氧化还原反应，通过改变O2-和H2O2的比例来增加肿瘤细胞的活性［12］。因此，在结直肠癌细胞中ANGPTL4的水解片段对肿瘤的生长起主要作用的是cANGPTL4，而不是全长的ANGPTL4或者nANGPTL4。

2.1.2 缺氧环境下 在肿瘤生长过程中，肿瘤细胞增生迅速，造成肿瘤微环境始终处于相对缺氧状态。缺氧的环境引发病理血管再生，形成新的血管以提供足够的氧气和营养，排除代谢产物，从而支持肿瘤的存活［13］。研究发现，ANGPTL4 的表达与缺氧诱导的转录因子1α（Hypoxia-inducible transcription factor 1α,HIF-1α）的表达高度相关，当HIF-1α引起机体缺氧效应时，缺氧状态越明显，ANGPTL4 的表达量越高，表明ANGPTL4 可能是缺氧环境下肿瘤血管新生的一个重要调节因子［14］。也有研究表明ANGPTL4 具有减弱血管新生的作用。Ito 等［15］发现ANGPTL4 作为一个抗血管新生因子，抑制了血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）促内皮细胞增殖的作用，而VEGF是血管新生的重要因子。当其观察在小鼠角膜新生血管化的通透性时，发现ANGPTL4也可大大削弱VEGF介导的角膜新生血管形成，而单独应用ANGPTL4于肿瘤组织时未观察到肿瘤组织新生血管的消退现象。基于上述研究结果，表明ANGPTL4 在血管新生中所起作用与所处环境和表达组织不同可能存在差异，究其原因可能与ANGPTL4在不同组织中具有不同的信号调控通路有关系。

2.2 ANGPTL4 与肿瘤的侵袭和转移 肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞扩散到远处的器官，通常是肿瘤发展中的最后一步。转移是导致多数癌症患者死亡的主要原因，是一个复杂的、多步骤的过程。肿瘤细胞首先侵入周围的组织，然后穿过淋巴管和血管系统的血管内皮进行转移，其一般具有很高的攻击性和抗癌耐药性。研究发现，全长的ANGPTL4 可抑制VEGF 介导的新生血管形成及其渗透性［15-16］。研究发现ANGPTL4 通过上调肝脏血管内皮细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）激活VCAM-1/整合素β1 信号通路，促进其内皮细胞逆向转移并引起肝癌细胞向肺部转移，从而形成新的转移瘤［17］。同时，Huang 等［18］研究发现c ANGPTL4 与整合素α5β1作用来激活Rac/PAK信号途径，以减弱内皮细胞之间的链接，导致血管通透性增强，共同促进癌细胞向肺部转移。ANGPTL4 在癌症转移组织中的高表达，表明其可能在肿瘤转移过程中起重要作用，从而认为ANGPTL4是肿瘤转移过程中的一个决定性介导因子。

2.3 与肿瘤的潜在临床应用价值 自ANGPTL4 发现以来，国内外关于其与各系统肿瘤的相互关系进行了大量的研究，但能否把它作为一种抗癌和抗转移靶标仍然存在较大争议。原因在于ANGPTL4 在肿瘤的生长和转移中起着多方面的作用，其对肿瘤的确切影响机制尚不明确。Nakayama等［19］通过免疫组织化学技术研究发现ANGPTL4在胃腺癌中的表达升高，ANGPTL4 可以促使微血管通道形成，对胃癌细胞的增殖和生长提供充足营养，增强胃癌细胞侵袭性，并为肿瘤转移提供途径。Nakayama等［20］再以同样的方法研究ANGPTL4在结直肠癌中的表达，进一步表明ANGPTL4 与肿瘤静脉浸润和远处转移有密切关系。另一项研究发现ANGPTL4 在正常乳腺上皮细胞呈高表达，而在乳腺原位癌中却表达下降，究其原因可能与ANGPTL4 基因的5’区域的CPG 岛的甲基化有关［21］。有研究者建立了一种基因改造的老鼠模型，该模型的卡波氏肉瘤中可表达一种病毒G-蛋白偶联受体（viral G protein-coupled receptor,vGPCR），在这种模型的卡波氏肉瘤中发现ANGPTL4 的表达受vGPCR的正调节，ANGPTL4表达的增加增强了该肉瘤内皮细胞的迁移和分化，这两者是血管新生中的重要步骤，从而促进新生血管形成。相反，当利用siRNA 抑制ANGPTL4的表达则会阻碍肿瘤新生血管的形成，降低血管渗透性，阻碍由vGPCR 介导的活体内肿瘤的发生［22-23］，故认为ANGPTL4 可能作为肿瘤研究的一种新的分子标记物。Zhang 等［24］研究发现阻碍ANGPTL4的表达可以抑制乳腺癌细胞向肺组织的扩散，进一步证实ANGPTL4 对于肿瘤的侵袭与转移有重要作用。Zhang等［25］采用了多种方法研究280例肝癌的癌组织和癌旁组织中ANGPTL4的分布，发现癌旁组织中ANGPTL4表达更高，并且与肿瘤的分级呈正相关，这可以作为一种新的评估肝癌的生物标记，但其能否评估肝癌的预后及生存率有待进一步研究。Katanasaka等［26］的研究证实了ANGPTL4在恶性神经胶质瘤细胞中的高表达是通过ERK/c-Myc 通路被一种变异的表皮生长因子所介导，而这种变异的表皮生长因子强烈诱导新生血管的形成可能与ANGPTL4的表达有关，该研究认为ANGPTL4的表达可作为一种有效的肿瘤标志物的预测指标。韩杰等［27］通过体外稳定转染技术,用半定量RT-PCR 和直接法ELISA 检测发现shRNA 沉默ANGPTL4 表达对大肠癌细胞系HT29 的迁移及伪足形成有明显抑制作用，表明ANGPTL4 在大肠癌细胞的转移中具有重要作用。上述研究结果表明，ANGPTL4 与多种癌症密切相关，使得ANGPTL4 具有作为生物标记、甚至是抗癌和抗转移靶标的潜在临床应用价值。但Hattori 等［18］关于乳腺原位癌的研究结果，却发现ANGPTL4在正常乳腺上皮细胞中高表达，而在乳腺原位癌细胞中表达降低，这一点促使我们在考虑实际应用这种潜在价值时需要慎重。

3 小结与展望

综上所述，目前的大量研究表明ANGPTL4 在癌症生长和转移过程中有着重要的作用。ANGPTL4在炎症条件下促使肿瘤细胞异常增殖，在缺氧环境下促进肿瘤血管新生，并通过增强血管渗透性促进肿瘤的浸润和转移。ANGPTL4 在肿瘤中的作用是复杂的，水解后的不同片段在癌症中作用不同，cANGPTL4可能与肿瘤关系更加密切。此外，在不同组织的肿瘤中，ANGPTL 4 表现出不同的作用，显示出环境和组织的特异性。根据它在临床各肿瘤中的潜在应用价值，ANGPTL4 可被作为多种癌症类型的诊断标记物［24-27］。而能否利用ANGPTL4 的抗体作为临床药物来提高治疗肿瘤的效果，是未来研究抗肿瘤药物的重要方向。

［1］Hato T,Tabata M,Oike Y.The role of angiopoietin-like proteins inangiogenesis and metabolism［J］.Trends Cardiovasc Med,2008,18（1）:6-14.

［2］Kim I,Kim HG,Kim H,et al.Hepatic expression,synthesis and secretion of a novel fibrinogen/angiopoietin-related protein that prevents endothelial-cell apoptosis［J］.Biochem J,2000,346:603-610.

［3］Yoon JC,Chickering TW,Rosen ED,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma target gene encoding a novel angiopoietin-related protein associated with adipose differentiation［J］.MolCellBiol,2000,20（14）:5343-5349.

［4］Lei X,Shi F,Basu D,et al.Proteolytic processing of angiopoietin-like protein 4 by proproteinconvertases modulates its inhibitory effects on lipoprotein lipase activity［J］.J BiolChem,2011,286（18）:15747-15756.

［5］Cazes A,Galaup A,Chomel C,et al.Extracellular matrixbound angiopoietin-like 4 inhibits endothelial cell adhesion,migration,and sprouting and alters actin cytoskeleton［J］.Circ Res,2006,99（11）:1207-1215.

［6］Ge H,Yang G,Huang L,et al.Oligomerization and regulated proteolytic processing of angiopoietin-like protein 4［J］.J BiolChem,2004,279（3）:2038-2045.

［7］Goh YY,Pal M,Chong HC,et al.Angiopoietin-like 4 interacts with integrins beta1 and beta5 to modulatekeratinocyte migration［J］.Am J Pathol,2010,177（6）:2791-2803.

［8］Huang RL,Teo Z,Chong HC,et al.ANGPTL4 modulates vascular junction integrity by integrin signaling and disruption of intercellular VE-cadherin and claudin-5 clusters［J］.Blood,2011,118（14）:3990-4002.

［9］Coussens LM,Werb Z.Inflammation and cancer［J］.Nature,2002,420（6917）:860-867.

［10］Legler DF,Bruckner M,Uetz-von AllmenE,et al.Prostaglandin E2 at new glance:novel insights in functional diversity offer therapeutic chances［J］.Int J Biochem Cell Biol 2010,42（2）:198-201.

［11］Kim SH,Park YY,Kim SW,et al.ANGPTL4 induction by prostaglandin E2 under hypoxic conditions promotes colorectal cancer progression［J］.Cancer Res,2011,71（22）:7010-7020.

［12］Zhu P,Tan MJ,Huang RL,et al.Angiopoietin-like 4 protein elevates the prosurvival intracellular O2（-）:H2O2ratio and confers anoikisresistance to tumors［J］.Cancer Cell 2011;19（3）:401-15.

［13］Bertout JA,Patel SA,Simon MC.The impact of O2 availability on human cancer［J］.Nat Rev Cancer,2008,8（12）:967-975.

［14］Le Jan S,Amy C,Cazes A,et al.Angiopoietin-like 4 is a proangiogenic factor produced during ischemia and in conventional renal cell carcinoma［J］.Am J Pathol,2003,162（5）:1521-1528.

［15］Ito Y,Oike Y,Yasunaga K,et al.Inhibition of angiogenesis and vascular leakiness by angiopoietinrelated protein 4［J］.Cancer Res,2003,63（20）:6651-6657.

［16］Hanahan D,Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the next generation［J］.Cell,2011,144（5）:646-674.

［17］Li H,Ge C,Zhao F,et al.HIF-1a-activatedANGPTL4 contributes to tumor metastasis via VCAM-1/integrin b1 signaling in human hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology,2011,54（3）:910-919.

［18］Huang RL,Teo Z,Chong HC,et al.ANGPTL4 modulates vascular junction integrity by integrin signaling and disruption of intercellular VE-cadherin and claudin-5 clusters［J］.Blood 2011;118:3990-4002.

［19］Nakayama T,Hirakawa H,Shibata K,et al.Expression of angiopoietin-like 4 in humangastric cancer:ANGPTL4 promotes venous invasion［J］.Oncol Rep,2010,24（3）:599-606.

［20］Nakayama T,Hirakawa H,Shibata K,et al.Expression of angiopoietin-like 4（ANGPTL4）in human colorectal cancer:ANGPTL4 promotes venous invasion and distant metastasis［J］.Oncol Rep,2011,25（4）:929-935.

［21］Hattori N,Okochi-Takada E,Kikuyama M,et al.Methylation silencing of angiopoietin-like 4 in rat and human mammarycarcinomas［J］.CancerSci,2011,102（7）:1337-1343.

［22］Ma T,Jham BC,Hu J,et al.Viral G protein-coupled receptor up-regulates Angiopoietin-like 4 promoting angiogenesis and vascular permeability in Kaposi's sarcoma［J］.ProcNatlAcadSci USA,2010,107（32）:14363-14368.

［23］Hu J,Jham BC,Ma T,et al.Angiopoietin-like 4:A Novel Molecular Hallmark in Oral Kaposi’s Sarcoma［J］.Oral Oncol,2011,47（5）:371-375.

［24］Zhang H,Wong CC,Wei H,et al.HIF-1-dependent expression of angiopoietin-like 4 and L1CAM mediates vascular metastasis of hypoxic breast cancer cells to the lungs［J］.Oncogene,2012,31（14）:1757-1770.

［25］Zhang H,Wei H,Ning S,et al.Evaluation of TGFβ,XPO4,elF5A2 and ANGPTL4 as biomarkers in HCC［J］.Experimentalandtherapeuticmedicine,2013,5（1）:119-127.

［26］Katanasaka Y,Kodera Y,Kitamura Y,et al.Epidermal growth factor receptor variant type III markedly accelerates angiogenesis and tumor growth via inducing c-myc mediated angiopoietin-like 4 expression in malignant glioma［J］.Mol Cancer,2013,12:31,

［27］韩杰,胡晓彤,黄学锋.shRNA 沉默ANGPTL4 表达对大肠癌HT-29细胞的迁移能力的影响［J］.南方医科大学学报,2011,31（9）:1614-1618.