骨髓间充质干细胞治疗缺血性脑卒中的研究与应用

谢 帆 综述，汤永红 审校

在过去的50 年里，关于缺血性脑卒中的治疗进行了大量临床前和临床试验，很少有药物是有效的保护或修复受损的中枢神经系统。然而，近10 年的研究都强烈推荐，细胞移植治疗各种中枢神经系统疾病（包括脑卒中）可能促进功能恢复。多种细胞类型研究表明，作为细胞源植入中枢神经系统疾病的动物模型后，包括胚胎干细胞，神经干细胞，脐带血单核细胞，诱导式多能干细胞（iPS细胞）和BMSC，可以在缺血后组织中生存，减轻神经元损伤，修复神经功能［1-3］。其中，BMSC 可能最具潜力，因为其可以从患者体内获得并不造成伦理或免疫困难。BMSC 是一种多潜能的非造血干细胞，具有自我增值、多系分化、免疫调节、归巢扩散能力，能分化成脂肪、骨、软骨，也可以分化为于胚胎无关的组织，包括神经细胞［4］。植入人工支架于受损部位能支持BMSC迁移，促进缺血性脑的修复和再生［5］。神经营养因子可大大提高BMSC 的迁移或到支架的侵袭，在缺血性脑损伤慢性期提供以后的再生潜力［6］。特别是粒细胞集落刺激因子（GCSF），可通过促进BMC迁移至缺血性脑加强神经和血管生成［7］。BMSC移植与其他先进技术科学、合理的融合以治疗缺血性脑卒中，为治疗提供新方向，为卒中患者带来新希望。

1 骨髓间充质干细胞治疗缺血性脑卒中的基础科学研究

1.1 BMSC 的神经再生、修复作用越来越多的证据表明，移植的BMSC 向受损的中枢神经系统组织迁移，促进脑梗死后运动功能的恢复。最近的研究表明，BMSC还能改善由于慢性脑缺血导致的认知功能障碍［8］。现在，BMSC被认为是通过分化成神经细胞和产生各种细胞因子或生长因子，抢救和修复受损的中枢神经系统；也可能通过释放一些神经保护或神经营养因子和抑制炎症反应来支持宿主神经细胞的生存［9-10］。在一定实验条件下，他们可以修改自己的基因表达谱，分化成神经元细胞［11］。因此，BMSC 本身能表达相关基因的神经元和神经胶质细胞。当BMSC与公开的神经元兴奋性氨基酸（谷氨酸）共同培养时，能显著地增加可溶性神经保护因子的释放，如神经生长因子和脑源性神经营养因子，修复神经细胞损伤［12］。BMSC能显著促进背根神经节的轴突生长,明显促进神经元突触在大脑和脊髓的延伸，增强梗塞周围区域的幸存皮层神经元的轴突发芽［13］。Chiba等［14］提出，BMSC 在中枢神经系统表现出旁观者机制，通过释放营养分子，拯救神经元，并促进当地的神经前体细胞增殖和成熟，它们对小胶质细胞和星形胶质细胞可以有抗炎和抗增殖作用，保护神经微环境。根据这些观察，BMSC可以通过多种机制由异质细胞群保护和修复中枢神经系统损伤。

1.2 BMSC 的趋化、增殖能力BMSC 在脑内移植后到达梗死脑依然有强大的增殖能力［15］。移植的BMSC 通过趋化因子系统向梗死组织迁移，如单核细胞趋化蛋白-1、基质细胞衍生因子-α、肝细胞生长因子［16］。大量研究证明，在梗塞周围区移植的BMSC 为神经元、星形胶质细胞和血管内皮细胞表达特定的蛋白质［17-18］。最近的一项研究表明，移植的BMSC能表达γ-氨基丁酸（GABA）受体和增强与梗死周围区的结合潜力［19］。

2 骨髓间充质干细胞治疗缺血性脑卒中的临床试验

2.1 BMSC 的临床试验现状 如上所述，基础实验的观测是令人鼓舞的。针对缺血性脑卒中患者的BMSC 移植的一些临床试验也已经启动。Bussolino F 等［20］为50例缺血性脑卒中后5～9 周的严重神经功能缺损病症，静脉注射自体BMSC，得出结论，自体BMSC输注是一个可行和安全的治疗方法，可促进功能恢复；Cai J等［21］为12例缺血性脑卒中后36～133天的患者静脉移植BMSC；Lee JS等［22］完成了一项开放式观察52例缺血性脑卒中患者的双盲临床试验，并随访他们长达5 年。他们的结论是，静脉移植自体BMSC 治疗缺血性脑卒中可能是一个安全和有效的策略。但是，我们应该清楚地提醒，没有任何临床试验证明细胞治疗的临床意义，包括BMSC的移植。

2.2 BMSC 的临床试验进展及问题 有许多变数可能会影响BMSC 移植在临床中的疗效。其中包括供体细胞（安全性、自体或同种异体、前体内细胞的扩展），患者因素（年龄和卒中类型），治疗因素（发病间隔时间，临床治疗路径和细胞剂量），验证因素（神经系统的评估和成像）［23］。现在是时候为发展神经保护药物从临床前研究中的问题吸取经验教训了。

首先，同种异体细胞被允许在发病后24 小时内使用，但需强制长期免疫抑制剂药物治疗［24］。患者自体BMSC作为供体细胞是理想的，但他们需要几个星期在前体内扩增。因此，建立一个可行的协议，安全、迅速扩增BMSC 是关键。BMSC 在大多数动物实验和临床试验中被包括胎牛血清的培养基培养。然而，胎牛血清携带朊病毒，存在病毒、或人畜共患病污染的潜在风险。虽然，自体血清可用于扩增BMSC，但可能需要大量的血清。最近，人类血小板裂解液已被证实可作为BMSC 扩增培养基的替代品。血小板裂解液中含介质，能扩增人类BMSC 并保留他们的迁移、存活和分化能力，立体定向移植到梗死脑时显著促进功能恢复［25］。因此，血小板裂解液可能是一个有临床价值的和安全的替代胎牛血清扩增BMSC 的方法。

第二，在大多数动物研究中BMSC于脑卒中造模后24 小时或7 天之内移植，而在之前的临床试验中他们通常是在发病后数周（甚至是几个月）后移植。因此，动物实验和临床试验的治疗协议之间存在着相当大的差距，这可能与临床前试验不足相关。粒细胞集落刺激因子（G-CSFs）可能是有用的，一定浓度的G-CSFs 可显著提高BMSC 的增殖能力，通过调节细胞周期，上调其产生的神经生长因子、肝细胞生长因子和基质细胞衍生因子-α［26］。因此，G-CSFs 可以加快治疗缺血性脑卒中细胞的扩增和缩短发病至移植治疗之间的时间间隔。众所周知，各种成体干细胞，包括BMSC 的老化会明显降低自我更新和分化能力。这一事实将对BMSC 移植治疗缺血性脑卒中的疗效产生显著影响。因为大多数缺血性脑卒中患者年事已高。近期有研究表明，G-CSF在老年动物中也能促进BMSC的增殖能力和神经营养因子的释放［27］。

第三，BMSC可以直接移植，或者静脉、动脉内或鞘内注射。直接（颅内）注射使供体细胞最快捷地在受损组织中定植。静脉内或鞘内注射移植是有吸引力的，因为它是一种非侵入性的、安全的技术，但有报道称相比直接移植它将导致更少的细胞迁移和功能恢复［28］。另外，动脉内注射BMSC非侵入性地交付给受损的中枢神经系统可能是有价值的［29］。因此，需要制定最佳的移植技术，最大限度的安全和高效的服务患者。值得关注的是，组织工程技术可以提供另一个途径来传递细胞。在其他器官如骨骼、软骨、心脏和皮肤，可降解的生物材料已经被接受作为一种有价值的“脚手架”来修复和稳定移植的细胞。然而，只有少数研究表示支架对细胞移植治疗中枢神经系统疾病有效。最近一项研究表明，纤维基质可提高BMSC的生存和迁移能力，对于缺血性脑卒中的治疗是一个有用的材料［30］。热可逆凝胶聚合物水凝胶为BMSC 提供一个合适的环境，也可能是一个候选支架［31］。然而，还没有临床试验进行这种技术在细胞治疗缺血性脑卒中疗效的检验。

最后，移植细胞在宿主中枢神经系统连续和非侵入性的示踪方法，这将是发展必不可缺的技术。磁共振成像、核医学成像和光学成像为主要候选方式。供体细胞可以在磁共振成像识别超顺磁性氧化铁剂标记［32］。磁共振成像可以直观完整、不透明的有机体，在三维空间具有良好的空间分辨率，但因为灵敏度低需要成像时间长，因此减缓数据采集。核成像通过放射性示踪剂标记发现移植的细胞。Tian F 等［33］通过99m TC-hexamethylpropylene（HMPAO）标记BMSC，并通过导管将其注射到缺血性脑卒中患者，移植的细胞通过单光子发射计算机断层扫描展现。核成像可以检测目标，具有高灵敏度，但由于临床上可用的示踪剂的半衰期相对较短，长期监视供体细胞有困难。另外，光学成像技术也可作为移植的BMSC在受损的中枢神经系统可视化的未来技术。量子点发射近红外荧光，具有较长的波长（800 纳米），可以很容易地穿透生物活体组织。近期的研究表明，当量子点标记的BMSC 移植到大鼠梗死脑组织，至少8 周后，仍可以通过体内荧光成像在头骨和头皮下清晰可见［34］。成像技术在BMSC 移植对宿主大脑功能影响的评估将是有临床价值的。

3 展 望

上文总结了BMSC 目前的基础科学进展和早期先进的临床应用。最近的研究已经强烈建议BMSC移植治疗缺血性脑卒中。但BMSC 的作用机制及临床应用设置等方面仍有待进一步研究。最新研究发现，神经细胞和血管成分之间一个重要的互动组件如神经血管单元，成为缺血性脑卒中潜在的治疗目标［35］。近期指出两个除了坏死和凋亡之外的神经细胞死亡机制：诱导细胞自噬和转录抑制非典型死亡，为卒中的治疗提供新的方向［36］。神经血管单元和额外的细胞死亡机制，对干细胞疗法的潜在疗效及研究方向的影响是未来研究的主题。而且，进一步的研究将为临床设置建立一个科学的行之有效的策略。此外，干细胞治疗与其他技术如血管再通操作相结合，将为患者提供额外的福利。

［1］Caiazzo M,Dell'anno MT,Dvoretskova E,et al.Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts［J］.Nature,2011,476:224-227.

［2］Cai J,Yang M,Poremsky E,et al.Dopaminergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells survive and integrate into 6-OHDA-lesioned rats［J］.Stem Cells Dev,2010,19:1017-1023.

［3］Buhnemann C,Scholz A,Bernreuther C,et al.Neuronal differentiation of transplanted embryonic stem cell-derived precursors in stroke lesions of adult rats［J］.Brain,2006,129:3238-3248.

［4］申娜，陈乃耀，郑丽坤，等.骨髓间充质干细胞的免疫调节活性［J］.第二军医大学学报,2009,30:717-721.

［5］Bliss T,Guzman R,Daadi M,et al.Cell transplantation therapy for stroke［J］.Stroke,2007,38:817-826.

［6］Chen SJ,Chang CM,Tsai SK,et al.Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue［J］.Stem Cells Dev,2010,19:1757-1767.

［7］Chiba Y,Kuroda S,Osanai T,et al.2011.Impact of ageing on biological features of bone marrow stromal cells（BMSC）in cell transplantation therapy for central nervous system disorders-Functional enhancement by granulocyte-colony stimulating factor（G-CSF）［J］.Neuropathologyadvance online publication,2011,11:608-622.

［8］Brenneman M,Sharma S,Harting M,et al.Autologous bone marrow mononuclear cells enhance recovery after acute ischemic stroke in young and middle-aged rats［J］.J Cereb Blood Flow Metab,2012,30:140-149.

［9］Buhnemann C,Scholz A,Bernreuther C,et al.Neuronal differentiation of transplanted embryonic stem cell-derived precursors in stroke lesions of adult rats［J］.Brain,2012,129:3238-3248.

［10］Abe K.Therapeutic potential of neurotrophic factors and neural stem cells against ischemic brain injury［J］.J Cereb Blood Flow Metab,2013,20:1393-1408.

［11］Abe K,Kogure K.Selective gene expression after brain ischemia［J］.Prog Brain Res,2013,96:221-236.

［12］Bang OY,Lee JS,Lee PH,et al.Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stroke patients［J］.Ann Neurol,2005,57:874-882.

［13］Bliss T,Guzman R,Daadi M,et al.Cell transplantation therapy for stroke［J］.Stroke,2007,38:817-826.

［14］Chiba Y,Kuroda S,Maruichi K,et al.Transplanted bone marrow stromal cells promote axonal regeneration and improve motor function in a rat spinal cord injury model［J］.Neurosurgery,2009,64:991-999.

［15］Abe K,Aoki M,Kawagoe J,et al.Ischemic delayed neuronal death.A mitochondrial hypothesis［J］.Stroke,2005,26:1478-1489.

［16］Borlongan CV,Chopp M,Steinberg GK,et al.Potential of stem/progenitor cells in treating stroke:the missing steps in translating cell therapy from laboratory to clinic［J］.Regen Med,2008,3:249-250.

［17］Alvarez-Buylla A,Garcia-Verdugo JM.Neurogenesis in adultsubventricularzone［J］.J Neurosci,2012,22:629-634.

［18］Arvidsson A,Collin T,Kirik D,et al.Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke［J］.Nat Med,2012,8:963-970.

［19］Abe K,Tanzi RE,Kogure K.Induction of HSP70 mRNA after transient ischemia in gerbil brain［J］.Neurosci Lett,2013,125:166-168.

［20］Bussolino F,Ziche M,Wang JM,et al.In vitro and in vivo activation of endothelial cells by colony-stimulating factors［J］.J Clin Invest,2013,87:986-995.

［21］Cai J,Yang M,Poremsky E,et al.Dopaminergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells survive and integrate into 6-OHDA-lesioned rats［J］.Stem Cells Dev,2011,19:1017-1023.

［22］Lee JS,Hong JM,Moon GJ,et al.A long-term follow-up study of intravenous autologous mesenchymal stem cell transplantation in patients with ischemic stroke［J］.Stem Cells,2010,28:1099-1106.

［23］Cavallaro AM,Lilleby K,Majolino I,et al.Three to six year follow-up of normal donors who received recombinant human granulocyte colony-stimulating factor［J］.Bone Marrow Transplant,2007,25:85-89.

［24］Dharmasaroja P.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells for the treatment of ischemic stroke［J］.J Clin Neurosci,2009,16:12-20.

［25］Hofstetter CP,Schwarz EJ,Hess D,et al.Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2012,99:2199-2204.

［26］Floel A,Warnecke T,Duning T,et al.Granulocyte-colony stimulating factor（G-CSF）in stroke patients with concomitant vascular disease-a randomized controlled trial［J］.PLoS One,2011,6:57-67.

［27］Piao CS,Gonzalez-Toledo ME,Xue YQ,et al.The role of stem cell factor and granulocyte-colony stimulating factor in brain repair during chronic stroke［J］.Cereb Blood Flow Metab,2009,29:759-770.

［28］Honmou O,Houkin K,Matsunaga T,et al.Intravenous administration of auto serum-expanded autologous mesenchymalstemcellsinstroke［J］.Brain,2011,134:1790-1807.

［29］Osanai T,Kuroda S,Sugiyama T,et al.2011.Therapeutic effects of intra-arterial delivery of bone marrow stromal cells in traumatic brain injury of rats in vivo cell tracking study by near-infrared fluorescence imaging［J］.Neurosurgeryadvance online publication,2011,70:163-178.

［30］Uccelli A,Benvenuto F,Laroni A,et al.Neuroprotective features of mesenchymal stem cells［J］.Best Pract Res Clin Haematol,2011,24:59-64.

［31］Yasuda H,Kuroda S,Shichinohe H,et al.Effect of biodegradable fibrin scaffold on survival,migration,and differentiation of transplanted bone marrow stromal cells after cortical injury in rats［J］.J Neurosurg,2013,112:336-344.

［32］Ito M,Kuroda S,Sugiyama T,et al.Validity of bone marrow stromal cell expansion by animal serum-free medium for cell transplantation therapy of cerebral infarct in rats-a serial MRI study［J］.Transl Stroke Res,2011,2:294-306.

［33］Tian F,Morimoto N,Liu W,et al.In vivo optical imaging of motor neuron autophagy in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis［J］.Autophagy,2011,7:985-992.

［34］Shichinohe H,Kuroda S,Lee JB,et al.In vivo tracking of bone marrow stromal cells transplanted into mice cerebral infarct by fluorescence optical imaging［J］.Brain Res Brain Res Protoc,2012,13:166-175.

［35］Zlokovic BV.Neurodegeneration and the neurovascular unit［J］.Nat Med,2013,16:1370-1371.

［36］Zhao T,Zhang ZN,Rong Z,et al.Immunogenicity of induced pluripotent stem cells［J］.Nature,2013,474:212-215.