氧化应激产物对内皮祖细胞的影响

廖文筠

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是干细胞领域的研究热点之一，其可以分化成熟为内皮细胞，参与血管形成及血管内皮损伤后修复，EPCs内活性氧类（Reactive oxygen species，Ros）生成失衡，将导致正常EPCs 生长周期紊乱，过多的ROS 甚至诱导其凋亡。虽然近年来有关EPCs 体外培养及ROS通过细胞信号通路诱导EPCs凋亡的研究已经取得很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决，本文主要对EPCs的生物学特性、EPCs相关的ROS增多机制、氧化应激信号通路对EPCs 功能影响等问题进行综述。

1 EPCs的来源、分类及鉴定

内皮祖细胞是Asahara等［1］在1997年首次从成人外周血中分离出的成熟内皮细胞的前体细胞，因为其可以分化成熟为内皮细胞，参与血管形成，所以在糖尿病血管病变中其增殖和修复能力对损伤血管的恢复有重要作用。EPCs 一般来源有外周血，骨髓和脐带血，来源不同的EPCs s 在分化过程中，表面标志物和形态会有差异，典型的EPCs特征会呈现梭形，细胞群会呈现出“鹅卵石”形态［2］。

EPCs最常见的分类方法是按照培养时间长短分类：前者在体外培养4～7 天获得，而晚期内皮祖细胞则需要更多的时间，一般为2～4 周。有学者研究表明，早期EPCs在体外培养两周后逐渐凋亡消失，而晚期EPCs在体外培养2～4周出现，并快速增殖，可以进行传代［3］。

EPCs 鉴定是通过细胞表面标志物，但还没有发现一种定义内皮祖细胞的特异性表面标志物。Peichev［4］等描述内皮祖细胞为VEGFR-2+/CD133+/CD34+细胞，Reyes［5］等通过研究证实了CD34+CD133+VEGFR-2+细胞可以分化为内皮祖细胞，并且可以发育为成熟的内皮细胞。最近研究表明E-selection,pecam-1,VE-cadherin 也可作为表面标志物去鉴定内皮祖细胞，还可通过检测其对FITC 标记的UEA-1 的吸附和内吞DiI-ac-LDL来进行细胞功能学的鉴定。

2 活性氧类ROS增多的相关机制对EPCs的功能影响

活性氧类是体内一类含氧的单电子还原产物，是电子在未能传递到末端氧化酶之前漏出呼吸链并消耗大约2%的氧产生，包括氧的一电子还原产物超氧阴离子（O2-）、二电子还原产物过氧化氢（H2O2）、三电子还原产物羟自由基（OH-）以及NO等。ROS的产生主要是线粒体状态向状态Ⅳ转换中高氧环境和还原态的呼吸链使大量电子漏出并还原氧分子而形成。ROS可以是细胞正常代谢的产物，也可由外源性因素刺激产生，极易与细胞内蛋白质、脂类、染色质DNA发生化学反应，引起细胞损伤。细胞内同时存在ROS生成和拮抗体系，当两者功能处于平衡状态时，细胞正常发育生长，如出现体系之间强弱不等，将导致正常细胞生长周期紊乱，甚至诱导细胞凋亡。

2.1 血管紧张素Ⅱ与NA D PH 氧化酶途径 LiH ong等［6］在血管紧张素Ⅱ诱导不同NA D PH 氧化酶（NO X）同系物与晚期内皮祖细胞衰退的相关性研究中提出血管紧张素Ⅱ使不同NADPH 氧化酶（NOX）同系物（如NOX2和NOX4）的上调而产生过量ROS，使晚期EPCs发生功能衰退。替米沙坦能有效地抑制这种级联反应，具有延缓EPCs 衰老的作用。血管紧张素Ⅱ通过上调NOX2 和NOX4 加速EPCs 凋亡，如果再能对NADPH氧化酶（NOX）进行特异性抑制，将会大大减少EPCs 凋亡，这为血管内皮损伤的修复和治疗提供新的思路。

2.2 Hka（高分子量激肽原裂解片段）途径 Hka（高分子量激肽原裂解片段）是等离子激肽释放酶-激肽系统的一个活性产物，其介导产生的ROS 加速了EPCs 衰老进程，抑制了内皮细胞功能。研究发现HKa通过激活ROS-p38激酶-p16（INK4a）信号级联反应加速EPCs 衰老进程，Dai J 等［7］经过实验得出Hka可能具有诱导EPCs衰退的潜能。

2.3 亚甲基四氢叶酸还原酶（Mthfr）途径 EPCs 的生物学功能及其生长状态对新生血管形成和内皮再生有重要作用，其促进血管修复功能取决于ROS 水平高低，亚甲基四氢叶酸还原酶（Mthfr）缺陷型细胞会导致内皮型一氧化氮合酶（eNOS）解偶联，ROS 升高以及SIRT1 表达下调而影响EPCs 的寿命，使其功能衰退［8］。也有相关研究报道，敲出Mthfr 基因的杂合体小鼠，其体内同型半胱氨酸水平升高了1.5-2倍。患高同型半胱氨酸血症的小鼠外周循环EPCs数量明显减少。以此同时，血循环中ROS升高而eNOS的含量降低，使SIRT1表达也下调，严重影响EPCs的分化能力。由此可见，亚甲基四氢叶酸还原酶与ROS的关系可通过SIRT1（Ⅲ类组蛋白去乙酰酶）来进行调节。有研究发现阿托伐他汀等药物可抑制同型半胱氨酸诱导所致的内皮祖细胞的功能障碍和凋亡，这为临床降脂药物治疗高同型半胱氨酸所致EPCs损伤提供了理论依据［9］。

2.4 炎症因子C反应蛋白 糖基化终末产物表达受体在机体炎症反应过程和内皮功能活动中扮演一个非常重要的角色，但如何调控糖基化终末产物表达并不清楚，C 反应蛋白（CRP）可能是一个关键因素，Chen J 等［10］研究报道CRP 可能通过上调了糖基化终末产物表达的受体，改变了抗氧化应激防御系统，增强了EPCs对氧化应激所致的凋亡的敏感性以及促进动脉硬化的发生与进展。如能研发对抗炎症因子C反应蛋白的特异性药物，降低EPCs 对氧化应激所致凋亡的敏感性，使其在循环中的数量提升，可有助于损伤血管的修复。

3 氧化应激信号通路对EPCs功能影响

3.1 P66shcA 通路 存在于哺乳动物中的三种Shc基因，被分别命名为ShcA、ShcB 和ShcC，其中ShcA的机制研究最为清楚。人的ShcA基因定位于第1条染色体（1q21），广泛表达于多个组织。其选择性拼接可产生两种mRNA，分别为p46Shc/p52Shc 和p66Shc，前者是同一种mRNA 由于翻译起始位点不同而产生的两种蛋白质。因p66Shc比另外两种蛋白质在N末端多出一个富含脯氨酸结构（CH2），因此获得了特殊的功能，在调节氧化应激和细胞凋亡、衰老过程中具有重要作用［11］。P66shcA 是调节凋亡应对氧化应激的一个基因，p66shcA敲出的小鼠在各种病理生理的干预下表现出ROS产物的降低和ROS诱导细胞死亡的抵抗力的增加。国内外研究证明了高糖环境可通过增加细胞内ROS 含量诱导细胞凋亡，Di Stefano V 等［12］发现内皮祖细胞在高糖的培养下上调了p66shcA蛋白的表达，暴露在高糖环境下的内皮祖细胞数量显著降低。p66shcA 基因敲出的EPCs 对高糖所致的氧化应激损伤表现不敏感。

p66shc可以上调细胞对氧化应激反应的敏感性，研究者可以通过抑制p66shc 氧化应激通路而达到抗氧化的目的，然而在血管系统p66shc表达的负调控机制方面的研究十分有限。Shuang Zhou等［13］研究探索了SIRT1 的重要功能，它是一种Ⅲ类组蛋白去乙酰酶，其对p66shc的表达和高糖诱导的氧化应激所致内皮功能障碍具有调节作用。在不同种类的Ⅲ类组蛋白去乙酰酶抑制剂的作用下人脐静脉血内皮细胞和239A细胞的p66shc基因转录物和蛋白的表达明显增加。腺病毒转染SIRT1的人脐静脉血内皮细胞SIRT1过度表达抑制高糖所致的氧化应激诱导的p66shc 上调。与链脲霉素诱导的野生型糖尿病小鼠相比，内皮特异性SIRT1转基因糖尿病小鼠减少p66shc表达（包括mRNA 和蛋白方面），改善血管内皮功能，减少累积的硝基酪氨酸和8-OHdG（氧化应激的标记）。相关学者发现SIRT1 能够结合p66shc 启动子区（-508bp—-250bp），导致组蛋白H3 结合到p66shc 启动子区域的乙酰化作用减弱，进而减少p66shc相关产物表达。P66shcA 通路的研究可以为氧化应激所致血管损伤的治疗提供理论基础，但目前对其具体的作用机理研究得还不够深入。

3.2 腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路 最近研究发现MnSOD 表达的降低可导致糖尿病EPCs 功能障碍。Xiao-Rong Wang 等［14］验证了AMPK 通路通过MnSOD 抑制高糖所诱导的线粒体ROS 生成改善EPCs的功能。在链脲霉素诱导的1型糖尿病小鼠内皮祖细胞中MnSOD蛋白表达下降。糖尿病的EPCs减少了MnSOD 的生成，增加了线粒体过氧化物产生。在人体内可以通过检测细胞的MnSOD 含量来判断ROS含量的水平，它们之间呈反比关系。

Xiao-Rong Wang 等通过实验研究发现：Ad-AMPK-DN 的转入抑制AMPK 的表达活性，MnSOD的产生减少，ROS 生成增加，使EPCs 不能很好的成管。糖尿病组加入AICAR（AMPK 激动剂）的EPCs成管较好。转入Ad-AMPK-DN的EPCs粘附，迁移能力下降，在糖尿病组加入AICAR 的EPCs 粘附、迁移能力得以恢复。PP2A是蛋白磷酸酶2A，糖尿病的影响下可使EPCs 的PP2A 生成增加，使AMPK 表达活性降低。在糖尿病组中转入PP2A siRNA，使AMPK的表达恢复，从而增加MnSOD 的生成。为了验证PP2A的作用效果，从而提高实验的严谨性，因此加入PP2A抑制剂OA（冈田酸），从而使受氧化应激损伤的EPCs 的AMPK 表达升高，增加了MnSOD 的水平，减少ROS 的生成。通过上述科学的实验得出，AMPK通过MnSOD 途径改善氧化应激损伤的EPCs 的血管生成功能。

3.3 PI3k/AKT 通路 有相关研究报道，匹格列酮具有阻断H2O2引发EPCs 凋亡的功能,其是一种过氧化物酶体增生物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR-γ）的激动剂，渥曼青霉素是PI3k/AKT 通路的阻断剂，当PI3k/AKT 通路被阻断后，匹格列酮不能有效发挥其抗凋亡的作用，这说明此通路与EPCs 内ROS 生成有明显的相关性［15］。他汀类药物和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）可以阻止由H2O2诱导的EPCs的凋亡,且通过对PI3K/AKT 途径的抑制这种抗凋亡作用可以被逆转［16］。PI3k/AKT 途径可能对EPCs 氧化应激反应的调控起着十分重要的作用，但目前在此方面的研究还十分有限。

4 小 结

内皮祖细胞在血管损伤的修复方面有着重大的作用，如果能减少氧化应激反应对EPCs的负面影响，将显著降低心血管疾病的发生率和死亡率，因此，研究氧化应激产物对EPCs 的影响具有重大的临床价值。但是，在国内外科研进展中，EPCs氧化应激相关的P66shcA 和PI3k/AKT 通路的研究还不够深入，其作用的具体机理还有待进一步研究。

［1］Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis［J］.Science,1997,275（5302）:964-967.

［2］Hur J,Yoon CH,Kim HS,et al.Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis ［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24（2）:288-293.

［3］Shantsila E,Watson T,Tse HF,et al.New insights on endothelial progenitor cell subpopulations and their angiogenic properties［J］.J Am Coll Cardiol,2008,51（6）:669-671.

［4］Peichev M,Naiyer AJ,Pereira D,et al.Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34（+）cells identifies a population of functional endothelial precursors［J］.Blood,2000,95（3）:952-958.

［5］Reyes M,Dudek A,Jahagirdar B,et al.Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow［J］.J Clin Invest,2002,109（3）:337-346.

［6］Li H,Liu Q,Wang N,et al.Correlation of different NADPH oxidase homologues with late endothelial progenitor cell senescence induced by angiotensin II:effect of telmisartan［J］.Intern Med,2011,50（16）:1631-1642.

［7］Dai J,Zhu X,Yoder MC,et al.Cleaved high-molecularweight kininogen accelerates the onset of endothelial progenitor cell senescence by induction of reactive oxygen species［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31（4）:883-889.

［8］Lemarié CA,Shbat L,Marchesi C,et al.Mthfr deficiency induces endothelial progenitor cell senescence via uncoupling of eNOS and downregulation of SIRT1［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2011,300（3）:H745-753.

［9］Bao XM,Wu CF,Lu GP.Atorvastatin inhibits homocysteine-induced dysfunction and apoptosis in endothelial progenitorcells［J］.Acta Pharmacol Sin,2010,31（4）:476-484.

［10］Chen J,Huang L,Song M,et al.C-reactive protein upregulates receptor for advanced glycation end products expression and alters antioxidant defenses in rat endothelial progenitor cells［J］.J Cardiovasc Pharmacol,2009,53（5）:359-367.

［11］Pellegrini M,Pacini S,Baldari CT.p66SHC:the apoptotic side of Shc Proteins［J］.Apoptosis,2005,10（1）:13-18.

［12］Di Stefano V,Cencioni C,Zaccagnini G,et al.p66ShcA modulates oxidative stress and survival of endothelial progenitor cells in response to high glucose［J］.Cardiovasc Res,2009,82（3）:421-429.

［13］Zhou S,Chen HZ,Wan YZ,et al.Repression of P66Shc expression by SIRT1 contributes to the prevention of hyperglycemia-induced endothelial dysfunction［J］.Circ Res,2011,109（6）:639-648.

［14］Wang XR,Zhang MW,Chen DD,et al.AMP-activated protein kinase rescues the angiogenic functions of endothelial progenitor cells via manganese superoxide dismutase induction in type 1 diabetes［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab,2011,300（6）:E1135-1145.

［15］Gensch C,Clever YP,Werner C,et al.The PPAR-gamma agonist pioglitazone increases neoangiogenesis and prevents apoptosis of endothelial progenitor cells.Atherosclerosis［J］.2007,192（1）:67-74.

［16］Crossland H,Constantin-Teodosiu D,Gardiner SM,et al.A potential role for Akt/FOXO signalling in both protein loss and the impairment of muscle carbohydrate oxidation during sepsis in rodent skeletal muscle［J］.Physiol，2008，586（Pt 22）:5589-5600.