浸渍式快速冷冻液的优化及冻结技术对脆肉鲩品质的影响

马晓斌，林婉玲，杨贤庆，*，刁石强，郝淑贤，马海霞

（1．广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088；2．中国水产科学研究院南海水产研究所，国家水产品加工技术研发中心，农业部水产品加工重点实验室，广东广州510300）

浸渍式快速冷冻液的优化及冻结技术对脆肉鲩品质的影响

马晓斌1，2，林婉玲2，杨贤庆2，*，刁石强2，郝淑贤2，马海霞2

（1．广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088；2．中国水产科学研究院南海水产研究所，国家水产品加工技术研发中心，农业部水产品加工重点实验室，广东广州510300）

为优化浸渍快速冻结的冷冻液配方，以乙醇、丙二醇、甜菜碱和氯化钠组成冷冻液，运用Box-Behnken实验设计原理进行实验设计，探讨冷冻液的最佳配比。并用此最佳冷冻液（-35℃）对脆肉鲩进行研究，比较-18℃冻结、直接浸渍冻结、间接浸渍冻结对脆肉鲩品质的影响。结果表明：以占冷冻液总质量分数计，由20%乙醇、10%丙二醇、7%甜菜碱和10%氯化钠和水组成的冷冻液，冻结点可达-66.10℃。采用-18℃冻结的样品与两种浸渍冻结的样品相比较，前者肌原纤维蛋白含量和总巯基含量低于后者，并且Ca2+-ATPase活性的损失高于后者。综合各项指标说明浸渍冻结利于减少蛋白的变性。

冷冻液，响应面法，脆肉鲩，冻结特性

浸渍冻结技术是利用低温的冷冻液与物品直接接触，在物品浸入液体后瞬间表层冻结，从而实现快速冷冻，是一种冻结速率快、低能耗加工技术[1-4]。直接浸渍冻结中的冷冻液与物品接触，对冷冻液的质量要求相对较高。浸渍冻结中所用的载冷剂包括醇类、糖类和盐类的水溶液等[2，5]。杨贤庆等[6]以甜菜碱、丙二醇、氯化钠与水组成的冷冻液，其冻结点偏高和黏度偏大，为了得到冻结点更低和黏度更小的冷冻液，所以需要对冷冻液进一步的优化。

脆肉鲩（Ctenopharyngodon idellus）的蛋白质含量比普通鲩鱼（草鱼）高，肉质紧密，肉味鲜美和久煮不烂。目前脆肉鲩主要以鲜活的方式进行运输和销售，很少对脆肉鲩进行加工，但随着脆肉鲩的产量及市场需求的日益增加，急需进行其他产品形式的深加工技术研究。冷冻鱼片是鱼类冷冻加工的主要产品形式之一，主要是采用空气鼓风冻结和间接冻结，阮征[7]和李汴生等[8]研究不同冻结速率和冻结温度对脆肉鲩品质的影响，指出提高冻结速率有利于保持脆肉鲩的品质。因此，寻找一种适合脆肉鲩加工的快速冻结工艺是扩大脆肉鲩加工的一种重要手段之一。邓敏等[9-10]研究了不同冻结方式和不同浸渍冻结温度对草鱼品质的影响，指出浸渍冻结优于常规空气鼓风冻结。但是，浸渍冻结技术对脆肉鲩品质研究鲜有报道。

因此，本实验在前期配方的基础上，通过采用响应面分析实验对浸渍冻结的冷冻液配方进行优化，得出最佳配比，然后用最佳配方研究浸渍快速冻结技术对脆肉鲩品质的影响，为脆肉鲩的保鲜加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脆肉鲩 广东省中山市坦洲镇某养殖场；蛋白定量（双缩脲法）试剂盒、Ca2+-ATP酶测试盒 江苏南京建成生物工程研究所；1-苯胺基-8-萘基磺酸（ANS）、DTNB 美国Sigma公司；其余试剂 均为分析纯。

DW-86L386海尔超低温冰箱 青岛海尔股份有限公司；735-2温度测量仪 德国德图仪器公司；TES 1310温度计探头 台湾泰仕电子工业股份有限公司；NDJ-8s数字黏度计 上海方瑞仪器有限公司；MettlerGB204电子天平 梅托勒-托利多仪器公司；SP 2558荧光光度计；UV-3000（PC） 紫外可见分光光度计；Sigma-3K30高速冷冻离心机 美国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 冷冻液冻结点的测定 参照杨贤庆等[6]方法进行测定。

1.2.2 冷冻液黏度的测定 参照杨贤庆等[6]方法，并稍作修改。为了准确的测定某一温度下的黏度值，在待测冷冻液外加无水乙醇，即将盛有冷冻液的烧杯置于无水乙醇大烧杯中。

1.2.3 Box-Behnken实验设计 在杨贤庆等[6]研究的基础上，主要研究乙醇（A）质量分数（10%～20%）、丙二醇（B）质量分数（2%～10%）、甜菜碱（C）（5%～ 15%）、氯化钠（D）质量分数（2%～10%）对冻结点和黏度的影响。采用响应面设计，运用Design-Expert 8.0数据分析软件进行Box-Behnken实验设计原理，以冻结点的绝对值与-20℃的黏度的比值为响应值，比值越大，冷冻液质量越好。设计四因素三水平的响应面分析实验，实验分析水平见表1。

表1 浸渍速冻冷冻液响应面实验因素水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.2.4 冻结和解冻 将脆肉鲩鱼片（以背部肉为主）均分为三组，分别做如下处理：

a.第一组直接置于-18℃冰箱冻结，当中心温度至-18℃时，用滤纸吸干样品表面残留的液体，密封于聚乙烯塑料袋中，在4℃下解冻备用；

b.第二组直接浸渍在优化后的冷冻液（-35℃）中冻结（直接浸渍冻结），冻结至中心温度为-18℃，用滤纸吸干样品表面残留的液体，密封于聚乙烯塑料袋中，在4℃下解冻备用；

c.第三组采用聚乙烯塑料袋真空包装后间接浸渍在优化后的冷冻液（-35℃）中冻结（间接浸渍冻结），当鱼片中心温度降至-18℃时，用滤纸吸干样品表面残留的液体，放置于4℃冰箱中解冻备用。

1.2.5 肌原纤维蛋白的提取 按照GB/T 18654.10-2002[11]进行取样，参照Hashimoto等[12]的方法进行提取。

1.2.6 蛋白含量的测定 采用蛋白定量（双缩脲法）试剂盒测定。

1.2.7 Ca2+-ATPase酶的活性测定 采用定磷法测定，使用Ca2+-ATP酶测试盒测定。

1.2.8 总巯基含量的测定 根据Ellman和Benjakul等方法，运用DTNB法[13-14]测定。

1.2.9 表面疏水性的测定 在Benjakul等[14]方法上稍作修改，激发波长366nm，发射波长470nm。

1.3 数据处理和统计分析

黏度值采用10次平行实验的均值，其余数据均为3次平行实验的均值，数据用均值±标准差表示。数据统计采用JMP7.0（SAS公司）和Excel 2003（微软公司）处理，蛋白质冷冻变性的变化运用ANOVA单因素方差分析及Tukey’s HSD法多重检验（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 响应面分析与实验结果

响应面分析实验[14-15]结果见表2，回归方程方差分析见表3。

经回归拟合后，实验因子对响应值的影响可以用回归方程表示为：

从表3可得整体模型的显著性水平p＜0.0001，说明所选用的二次多项式模型具有显著性，能够很好的反应各因素与响应值之间的关系，可以运用该回归方程确定最佳冷冻液的配方。失拟性检验p= 0.1851＞0.05，表明差异不显著，说明残差有随机误差引起。R2=0.9374，表明曲线的拟合程度较高。由表3的方差分析可以看出，A、B、C、D、AC、A2为显著性影响因素。影响因素的显著性次序为丙二醇＞乙醇＞氯化钠＞甜菜碱。

2.2 配方的响应曲面分析与优化

从表3可知，只有AC响应值的变化具有显著性的影响，于是列出了乙醇和甜菜碱对冷冻液质量影响的响应面图，其余均未列出。

表2 响应面分析实验结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

图1 乙醇和甜菜碱质量分数对冷冻液质量的影响响应面图Fig.1 Response surface plots showing the interactive effects of ethanol and betaine concentration on the freezing pointof immersion solution

由图1可知，乙醇对响应值的影响较甜菜碱显著，当乙醇质量分数为20%时，随甜菜碱的含量增加，响应值变化较小，这可能与甜菜碱具有较大的黏度有关。

通过回归方程求解得到最大值，得到冷冻液最佳配方是20.00%乙醇、10.00%丙二醇、7.00%甜菜碱和10.00%氯化钠，由模型方程预测得到的响应值是1.20。

表3 回归方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regressionmodel

根据响应面优化的结果，以20%乙醇、10%丙二醇、7%甜菜碱和10%氯化钠为配方，进行验证实验，响应值为1.18±0.02，冻结点为（-66.11±0.056）℃，-20℃黏度为（55.73±1.18）mPa·s，且-35℃黏度为（154.26± 1.81）mPa·s，该配方比杨贤庆等[6]研究的冻结点低，黏度较小，质量好。可能是由于乙醇的加入，与其他几种物质相互作用，有助于其冻结点和黏度的降低。根据单样本t检验，与模型方程预测值无显著性差异（p＞0.05），表明实际测的值与模型方程预测一致。

2.3 冻结曲线

图2 不同冻结方式的冻结曲线Fig.2 Freezing curve under different freezing processing conditions

图2为脆肉鲩块分别在3种不同冻结方式下的冻结曲线。从图2可知，浸渍冻结通过最大冰晶生成带（冻结点）的时间少于-18℃冻结。-18℃、直接浸渍和间接浸渍冻结至鱼块中心温度-18℃分别需要6.3、0.38、0.43h，可知直接浸渍和间接浸渍冻结的速率大于-18℃冻结，直截浸渍冻结的速率和间接浸渍冻结速率差不大。Jeremiah研究指出冻结速率快，形成的冰晶体积小，数量多，分布均匀，对组织细胞的破坏作用小，可以较好的保持食品的品质[16]。

2.4 冻结前后蛋白质冷冻变性的变化

2.4.1 肌原纤维蛋白含量的变化 鱼肉在冻结过程中，肌原纤维蛋白发生变性导致其盐溶性发生变化，盐溶性蛋白的含量减少[18]。通常鱼肉蛋白的冷冻变性越严重，其盐溶性蛋白的含量越低。从表4可以看出，与新鲜鱼块相比，冻结后样品的肌原纤维蛋白含量的溶出量有不同程度的降低，直接浸渍和间接浸渍冻结下降的程度比-18℃冻结的小。由图2可知，直接浸渍和间接浸渍冻结速率快，快速的通过最大冰晶生长带，在冻结的鱼肉形成的冰晶细小且均匀，对肌肉组织破坏较小，因此直接浸渍和间接浸渍冻结对蛋白质变性程度较小，提取的肌原纤维含量相对-18℃冻结的高。

2.4.2 Ca2+-ATPase酶的活性的变化 Ca2+-ATP酶活性来源于肌球蛋白，表征其头部S-1片段的性质，是衡量蛋白质冷冻变性的重要指标[19]。冻结前后样品的Ca2+-ATP酶活都有不同程度的降低，Ca2+-ATP酶活性降低程度分别经直接浸渍和间接浸渍冻结的样品其蛋白变性的程度比经-18℃冻结小。经-18℃冻结Ca2+-ATP酶活性下降程度最大，说明冻结速率慢，通过最大冰晶生长带时间长，肌球蛋白的完整性易破坏，蛋白容易发生变性。而经直接浸渍和间接浸渍的样品冻结速率快，有助于快速通过最大冰结晶生成区，从而可以减缓脆肉鲩蛋白的冷冻变性。

2.4.3 总巯基含量的变化 巯基是鱼肉蛋白中最具有反应活性基团，巯基对于稳定肌原纤维蛋白空间结构具有主要的意义。巯基含量的变化反映蛋白的变性程度[20]。由表4可知，经-18℃冻结处理后的总巯基含量显著下降，而经过直接浸渍和间接浸渍冻结处理后的几乎没有下降。因此可推测出，-18℃冻结速率慢，形成了较大和较多的冰晶，很大程度上破坏了蛋白的结构，埋藏在其分子内部的巯基更加容易暴露，易氧化而形成二硫键，从而总巯基含量下降。

2.4.4 表面疏水性的变化 蛋白质的表面疏水性反映的是蛋白质分子表面疏水性氨基酸的相对含量，也可以用它来衡量蛋白质的变性程度[21]。表4可以看出经过不同冻结方式的处理后，表面疏水性都显著增加，直接浸渍和间接浸渍冻结的增加量比-18℃冻结的少。在冻结的过程中蛋白质表面疏水性的增加是由于蛋白质的伸展和疏水性脂肪族及芳香族氨基酸的暴露，破坏了蛋白质原来的空间构象，从而蛋白质表面疏水性增加[22]。

3 结论

3.1 利用Box-Behnken实验设计和响应面分析法，探讨浸渍快速冻结的冻结液配方的最佳配比为：以占冷冻液总质量分数计，20%乙醇、10%丙二醇、7%甜菜碱和10%氯化钠。此条件下的冷冻液的冻结点可达-66.10℃。

3.2 并运用此最佳冷冻液（-35℃）进行研究，采用-18℃冻结、直接浸渍冻结和间接浸渍冻结的样品，冻结后肌原纤维蛋白含量、Ca2+-ATPase活性的损失和总巯基含量都有不同程度的降低，而直截浸渍冻结和间接浸渍冻结降低的幅度小。综合各指标，可以得出经快速浸渍冻结对脆肉鲩的品质优于-18℃冻结。

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表4 冻结前后蛋白质冷冻变性的变化Table 4 Change in protein frozen denaturation after freezing

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Optim ization of immersion solution for quick freezing and the effect of freezing technology on the quality characteristics of crisp grass carp

MA Xiao-bin1，2，LINW an-ling2，YANG Xian-qing2，*，DIAO Shi-qiang2，HAO Shu-xian2，MA Hai-xia2
（1.College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，National Research and Development Center for Aquatic Product Processing，Key Laboratory of Aquatic Product Processing，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China）

An immersion solution for quick freezing was using ethanol，p ropaned iol，betaine and sodium chloride. A Box-Behnken experimental design was used to exp lore op timal immersion solution formulation.The op timal immersion solution was used to study on crisp g rass carp，com pared the influence of immersion and chilling freezing and trad itional-18℃ on the quality changes of crisp g rass carp.A freezing point of-66.10℃ was observed for an aqueous immersion solution containing，on a total d ipp ing solution weight basis，20%ethanol，10%p ropaned iol，7%betaine and 10%sodium chloride，respectively.Com pared w ith the other two freezing p rocessing，crisp grass carp frozen in-18℃had lower contentofm yofibrillar p rotein and total-SH，more reduced Ca2+-ATPase activity.The results of physicochem ical and textural charac teristics ind icated that immersion and chilling freezing could assist to reduce the denaturation of fish p rotein.

immersion solution；response surfacemethodology；crisp g rass carp；freezing characteristics

TS254.4

A

1002-0306（2014）18-0338-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.067

2013－12－31 *通讯联系人

马晓斌（1988-），男，硕士研究生，主要从事水产品加工与贮藏方面的研究。

国家科技支撑计划项目（2012BAD28B00）；农业部水产品加工重点实验室项目（nybjg201202）。