绞股蓝皂苷提取纯化工艺研究进展

张新宇，张 笛，王 琳，徐作华，刘 坤，曾庆梅，*

（1.安徽省芬格欣普蓝生物药业有限公司，安徽阜阳236500；2.合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥230009）

绞股蓝皂苷提取纯化工艺研究进展

张新宇1，张 笛2，王 琳2，徐作华1，刘 坤2，曾庆梅2，*

（1.安徽省芬格欣普蓝生物药业有限公司，安徽阜阳236500；2.合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥230009）

绞股蓝皂苷是绞股蓝主要的活性物质，因其具有抗疲劳、抗衰老、抗诱变，提高机体免疫能力、调节心脑血管和改善神经系统等独特的生理调节功效，有巨大的开发价值和应用潜力。本文从提取工艺、纯化工艺两个方面综述了绞股蓝皂苷的研究进展，为进一步研究绞股蓝皂苷提取、纯化工艺提供了线索和依据。

绞股蓝皂苷，提取，纯化

绞股蓝又名七叶胆、五叶参，是葫芦科绞股蓝属多年生草质藤木，在我国陕西、四川、湖南、广西、云南等省均有分布，有“南方人参”的美誉，在日本被誉为“福音草”[1]。有关绞股蓝皂苷的研究日本走在了世界前列，早在20世纪70年代后期，日本学者已从该植物中分离出80多种皂甙，发现有4种绞股蓝皂苷分别与人参皂苷Rb1、Rb3、Rd和F2的结构完全相同，并且绞股蓝总皂苷含量是人参的3倍[2-4]。现代药理、毒理及临床实验证明：绞股蓝主要有效成分为绞股蓝皂苷，具有抗疲劳、抗衰老、抗诱变、提高机体免疫能力、调节心脑血管和改善神经系统等作用[5-6]。绞股蓝皂苷因其独特的功效，可开发用于绞股蓝茶制品、功能性口服液、保健酒、抗衰老化妆品、饲料添加剂等[7-8]。但目前，绞股蓝更多的是简单加工为绞股蓝茶，而对于其中有效成分绞股蓝皂苷的提取、纯化及加工利用程度还远远不够，因此研究开发较好的绞股蓝皂苷提取和纯化工艺对绞股蓝深入开发具有重要意义。目前对绞股蓝皂苷的综述文章主要关注于绞股蓝皂苷的药理功能及简单实验提取，而忽略绞股蓝皂苷提取工艺的工化应用，进一步纯化方面的综述文章也鲜有报道，本文充分结合工艺应用和装置的可行性对绞股蓝皂苷提取、纯化的研究进行综述。

1 绞股蓝皂苷提取方法

绞股蓝皂苷的提取主要是根据极性相似相溶原理，选用对目标组分溶解度大，对不需要组分溶解度小的溶剂，并辅助一定的破壁措施将绞股蓝皂苷从绞股蓝组织细胞提取出来。目前已有报道的绞股蓝皂苷提取方法有溶剂热提取、超声波提取、酶法提取、微波提取、超临界流体萃取及超高压提取。其中超临界流体萃取及超高压提取可以作为绞股蓝皂苷提取的重点研究内容。

1.1 溶剂热提取

绞股蓝皂苷含有多个糖基，极性较大，可溶于水、甲醇、乙醇等溶剂，因此溶剂热提取绞股蓝皂苷时，常用水提和醇提，采取煎煮、回流提取、索氏提取等措施。水提法因其工艺简单、成本较低、无溶剂污染，而被作为粗提的常用方法，林硕等[9]通过考察料液比、提取时间和提取温度对水提效果的影响，在最优化条件下绞股蓝皂苷得率为7.79%，纯度为26.85%。但水提取液中常含有无机盐、糖、蛋白质等水溶性杂质，另外水提液还常含有黏液，浓缩时易产生泡沫，给下一步浓缩分离带来困难。为了克服单纯水提的弊端，提高提取液的稳定性，刘晓颖[10]、仇小艳等[11]采用一定质量分数的甲醇、乙醇分别提取绞股蓝皂苷，比较了80%甲醇、75%乙醇提取绞股蓝总皂苷的不同效果，通过测定发现75%乙醇和80%甲醇提取效果明显高于水提，且乙醇提取效果高于甲醇，如用乙醇回流提取绞股蓝皂苷可获得更优提取效果。另外，采用一定质量分数的乙醇提取可防止形成加合物[12]，乙醇较强的挥发性也便于以后的分离纯化和回收再利用，减少了生产成本。另外还可采用连续逆流提取，增加提取次数，充分利用溶剂。

因原料的粉碎度、溶剂浓度、料液比、提取温度、时间、次数、提取方式以及设备条件等因素都能影响提取效率，所以必须加以综合考虑[13-14]。溶剂热法提取绞股蓝皂苷工艺相对简单，设备要求低，便于工业化生产，但溶剂热提取难以取得理想的破壁效果，存在耗时长，能耗高，提取率低，溶剂损耗大等问题，需要辅助其他更有效的破壁提取措施来克服单纯溶剂热提取的缺点。

1.2 超声波提取

超声波的作用是辅助溶剂提取，弥补单纯溶剂热提取破壁不理想的缺陷。超声波的空化效应及引起的一系列次级效应能实现破壁、加速提取成分的扩散释放的作用。另外，超声波也可以转化为热能加快样品中有效成分的扩散速度，从而更高效、快速提取植物细胞内容物[15-16]。陈艳莉[17]利用超声法提取绞股蓝皂苷，可以大大缩短提取时间，并提高绞股蓝皂苷的浸出率，且随着超声时间的延长皂苷提取率相应提高，但并不是无限提高，所以选择合适的超声时间也很重要。林硕等[18]选择不同频率的超声波进行提取，并与传统水浴提取的结果进行对比，发现超声波频率对绞股蓝皂苷的提取过程有显著影响，28kHz超声波对绞股蓝皂苷提取过程的强化作用明显，但40kHz时超声波提取效果与传统水浴提取无明显差异，超声波提取绞股蓝皂苷工艺提取结果稳定、重现性好。

需要注意的是，超声波提取虽无需额外的热源，但由于超声波的热效应，必须合理优化超声功率和时间，适当控制温度不要超出一定范围，防止皂苷过热分解。另外，容器壁的厚薄及容器在超声波装置中的位置都会影响超声提取的结果，而且目前实验研究都是处于小规模，要用于大规模生产，还有待于进一步解决工程设备的放大问题，如超声场的范围和强度、噪声的控制、超声的大功率问题都制约着超声波在工业化生产中的大规模应用。

1.3 酶法提取

绞股蓝的细胞壁主要是由纤维素和果胶组成，而皂苷等有效成分往往包裹在细胞壁内，目前绞股蓝皂苷酶法提取工艺主要是利用纤维素酶及果胶酶破坏细胞壁组成成分，增加绞股蓝皂苷的溶出率，从而提高提取率。

纤维素酶可以破坏β-D-葡萄糖苷键连接，从而使植物细胞壁破坏，减小有效成分的溶出阻力。邓美林等[19]利用纤维素酶法提取绞股蓝总皂苷，将绞股蓝粉碎至120目，酶用量0.4%、酶解温度45℃、提取时间为150m in、提取温度为50℃等条件下，绞股蓝总皂苷提取率为3.81%。黄山等[20]同样采用纤维素酶提取绞股蓝总皂苷，在最佳工艺条件下，绞股蓝总皂苷提取率达4.60%，与热水浸提法相比提取率提高了17.05%。果胶酶能够破坏绞股蓝细胞壁中的果胶物质，同纤维素酶一样有破除细胞壁加快皂苷溶出的效果。林硕等[21]研究了酶用量、pH、酶解温度、酶解时间对果胶酶法提取绞股蓝皂苷的影响。经过正交法优化提取工艺为：果胶酶用量为0.35%，pH为4.0，酶解温度为50℃，酶解时间为90m in，高温灭酶提取16min，皂苷得率达7.9201%，较常规的水酶法提取增加了9.4148%。

可以看出，研究者大多只考虑一种酶的作用，相比传统的溶剂热提取虽然能够提高绞股蓝皂苷的提取率，但与超声波提取相比明显耗时较长，而且酶的加入增加了生产成本、生产步骤和能耗，下一步可以尝试多种酶的复配组合提取，发挥不同种酶的优势，加强破壁效果，提高绞股蓝皂苷的得率。另外，酶法提取必须综合考虑酶的浓度、温度、抑制剂和引发剂等对提取物的影响才有可能克服酶法的缺点并应用于实际生产。

1.4 微波提取

微波提取由于能对提取体系中的不同组分进行选择性加热，因此具有较好的选择性，且热效率高、升温快速均匀，可大大提高提取物纯度，方便分离后处理[22-23]。该技术大多作为辅助措施用于天然产物的水提、醇提。但微波提取应用于提取绞股蓝皂苷的文献较少，仅南昌大学的郭辉力等[24]相对系统地研究过以微波辅助提取绞股蓝皂苷，提出了微波干法预处理-乙醇快速浸泡提取的新工艺，并与传统的乙醇回流提取进行比较，不仅提取时间缩短了近9h，提取率也提高了15.8%。此工艺较直接用溶剂浸泡进行微波辐射，能有效避免绞股蓝细胞内外同时加热与微波能被溶剂消耗而造成破壁不理想的情况出现，这样既可提高微波提取效率，节省能源，又可简化微波提取装置，降低投入成本，利于工业化生产。虽然绞股蓝皂苷的微波提取研究较少，但同类型的皂苷，如人参皂苷[22，25-26]，国内外研究还是比较深入的，可以作为绞股蓝皂苷微波提取的参考。

微波可以产生瞬时高温，必须合理控制微波时间。为了减少高温的影响，可分次进行微波辐射，冷却至室温再进行第二次微波辐射，减少热分解以便提高皂苷得率。绞股蓝在提取前应粉碎至合适粒度，既增大提取溶剂与物料的接触面积，提高微波提取的效率，又可防止杂质过度暴露，增加后续处理难度。目前微波提取设备的研发相对成熟，可以满足各类大、中、小企业的生产需求。

1.5 超临界CO2萃取

由于超临界CO2只能有效地萃取亲脂性物质，对相对质量分子较大、羟基多、极性较大的皂苷类物质提取其产率普遍较低，需要加入夹带剂、表面活性剂以及其他强化措施来提高产率[27-28]。为了提高皂苷产率，罗登林等[29]采用超声强化超临界CO2萃取人参皂苷，与单纯的超临界CO2萃取相比超声的加入能明显提高超临界CO2萃取人参皂苷的萃取率和生产效率，这可能是由于超声的破碎细胞壁作用导致溶质扩散阻力减小，增加了与超临界流体的接触面积。之后他又将特定的表面活性剂、乙醇和水形成反相微乳液引入到超临界CO2体系中增加对皂苷的溶解度，并与乙醇/水/超临界CO2萃取进行比较，发现其萃取率是乙醇/水/超临界CO2萃取的3.2倍[30]。

除了采取强化措施来提高超临界CO2萃取皂苷的萃取率和生产效率外，也应该注意萃取前样品的制备和预处理，比如样品粒度、样品的装填密度、样品溶液的酸碱度等都影响溶质的扩散速度和皂苷的存在形式从而影响皂苷得率及皂苷的化学结构[31]。

1.6 超高压提取

超高压提取的升压、保压、卸压过程能够加速溶剂与细胞基质间的扩散、渗透、溶解，使提取速率大大提高，提取时间大大缩短[32]。虽然利用超高压提取绞股蓝中皂苷的文献鲜有报道，但超高压在人参皂苷提取方面的成果可以作为重要参照。吉林大学的陈瑞战等[33-35]在超高压技术提取人参皂苷方面成果较多，他们探讨了不同提取溶剂、溶剂浓度、提取压力、溶剂与原料比、提取时间等因素对皂苷得率的影响，并将超高压提取法与回流提取、超声提取、微波提取、超临界CO2萃取等方法进行了比较，研究发现超高压在提取具有提取率高、溶杂少、能耗低、操作方便、快速等优点，而且超高压是在常温下操作，能最大程度地保留生物活性物质及各种营养成分的天然结构，避免了因热效应引起的有效成分变性、损失、药理活性降低等问题，同时超高的压力也使绝大多数细菌失活，有利于产品的保藏。

另外，在一定压力下所产生的凝聚作用可以打破酶和基质间的隔离，使酶活上升，加速酶促反应[36]。继续提高压力，既可以增加皂苷溶出率又可以改变酶蛋白的结构而起到钝酶的作用[37]，防止内容物过多溶出，增加后续纯化的难度。超高压如果辅助酶法提取，既可充分发挥酶的催化活性，又可充分利用超高压破壁、钝酶的作用，双重作用增强破壁效果。综上可以看出，超高压提取完全可以作为绞股蓝皂苷提取的重要研究方向。虽然超高压有诸多优势，但仍面临一些实际问题，如提取工艺参数的协同效应、有限的提取容积、设备的产能、设备投资费用等。

2 绞股蓝皂苷纯化方法

绞股蓝皂苷经一定方法提取后，其中往往含有大量的杂质，不仅影响绞股蓝产品的品质，而且很大程度上影响了理化参数的测定、疗效的评价、以及相关标准的制定等深层次的研究，因此对粗提物的分离纯化具有十分重要的实用价值和理论意义。

2.1 大孔吸附树脂分离纯化

大孔树脂具有良好的选择性、吸附量大、易洗脱、耐污染、再生处理后重复使用，因而在天然产物有效成分分离纯化领域的应用不断增加[38-39]。罗娅君等[40]考察了D101、D141、NAK-Ⅱ、AB-8型等3种大孔吸附树脂富集、纯化绞股蓝总皂苷的工艺，经比较发现，D-101型纯化效果最好，绞股蓝总皂苷含量可以达到50.69%。在最优工艺条件下，绞股蓝总皂苷可达89.61%（以人参皂苷Rb3计）。刘振洋等[41]研究了AB-8、ADS-7、D-101、HPD-100、HPD-300、HPD-700型等6种大孔吸附树脂对绞股蓝总皂苷的饱和吸附量、洗脱量及洗脱率，除ADS-7型大孔吸附树脂外其他5种型号对绞股蓝总皂苷的静态吸附能力均较好，其中AB-8型的静态饱和吸附量最大，为120.25mg·g-1干树脂，而HPD-700型树脂吸附的洗脱率最高，可达80.34%，其吸附量大、收率高、洗脱率高等优点，综合比较，将HPD-700型大孔树脂应用于绞股蓝总皂苷的初级纯化是非常合适的。

大孔吸附树脂法是目前纯化工艺较简单，效率较高，收率和纯度都比较理想的绞股蓝皂苷富集和纯化方法，完全可以替代传统溶剂萃取纯化工艺。但大孔吸附树脂纯化技术在绞股蓝皂苷纯化的应用中更多的关注目标产物的纯化，而忽略了大孔树脂预处理效果及提取物中树脂残留物和裂解产物的检测，因此对大孔树脂纯化的绞股蓝产品需制定合理的限量标准来确保产品质量和安全。

2.2 膜分离法

膜分离是以选择性的透过膜为分离介质，利用膜两侧不同的电位差、浓度差或者压力差使原料中的组分选择性透过一定孔径的膜，从而实现混合物分离、提纯、浓缩的过程[42-43]。利用膜分离进行纯化时，为了提高处理速度、处理量以及稳定性，往往采用不同孔径的膜进行多步过滤。易克传等[44]分别选用陶瓷微滤膜和超滤膜进行两步膜分离，在溶液温度40℃、过滤压差0.24MPa条件下，利用孔径0.5μm的陶瓷膜对绞股蓝粗取液进行预处理，保障了下一步超滤的稳定性。在后续的研究中选择截留相对分子质量为3×104的超滤膜，在溶液温度40℃、操作压力2MPa的条件下纯化绞股蓝皂苷，工艺过程稳定，产品纯度较高[45]。

采用不同截留分子量的膜进行分步膜分离，处理量大，处理效果较为理想，可以很好的实现绞股蓝皂苷的连续化生产，有很好的工业前景。当然，膜分离也存在污染严重、清洗困难、膜更换困难、造价较高等实际问题，但随着膜分离研究开发的深入，必将推动粗提液分离纯化的工业化进程。

2.3 硅胶柱色谱分离纯化

绞股蓝成分中的多糖、黄酮等水溶性物质由于极性较大，易吸附于硅胶上，而极性较弱的皂苷不易被吸附，而容易被洗脱下来，因此根据这个性质，可利用硅胶柱色谱法将绞股蓝中的总皂苷与其他物质分离开来。

孔玉琼等[46]利用用硅胶柱色谱分离绞股蓝总皂苷，以氯仿-甲醇混合液为流动相进行梯度洗脱，薄层层析法跟踪检测。将5000g绞股蓝干草经乙醇提、石油醚脱脂、正丁醇萃取、AB-8大孔吸附树脂脱糖、D-296阴离子交换树脂脱色后得到总皂苷7.87g，取5g绞股蓝总皂苷进行硅胶柱色谱分离，在体积比为9.5∶0.5和9∶1的氯仿-甲醇洗脱液洗脱下得到3种较纯的绞股蓝皂苷的单体组分，得率分别为2.6%、3.0%和5.2%。经高效液相色谱检测其纯度，组分A、B、C纯度分别为88.73%、93.11%和78.54%。3种皂苷较粗品纯度得到很大提高。KIM JH等[47]将得到的绞股蓝粗提液先用大孔树脂HP-20分离纯化，然后将甲醇洗脱的部分真空干燥成粉，之后进行硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇-水（65∶35∶10）洗脱，洗脱组分进一步经过ODS硅胶柱（洗脱液∶甲醇-水）得到绞股蓝皂甙GC1-7等单体。Hu L等[48]选取地上部分的绞股蓝依次用汽油、三氯甲烷和甲醇浸提，然后用水和正丁醇的混合溶液萃取甲醇提取液，取正丁醇层进行硅胶柱色谱分离，洗脱液为三氯甲烷-甲醇-水（7∶3∶0.1），收集洗脱组分进行RP-18色谱分离（洗脱液：甲醇-水或乙腈-水），最后得到9种化合物，经检测其中有6种为已知绞股蓝皂苷。

硅胶柱色谱分离纯化绞股蓝皂苷使研究和评价绞股蓝单体生物活性成为可能，但由于硅胶柱步骤繁琐，增加了生产成本，降低了生产效率，仅适合实验室作方法机理研究，无法工业化推广。

2.4 高速逆流色谱法

高速逆流色谱有效地分离强极性的组分，实现物质的对流分配，具有较强的适应性[49]，能在一个流程中分离样品中极性差异极大的各个组分，为从复杂的天然产物粗制品中提取不同特性的有效成分提供了有利条件[50]。

目前高速逆流色谱已经成功运用于与绞股蓝皂苷为同类皂苷的人参皂苷。孙成贺等[51]应用制备型高速逆流色谱，选择乙酸乙酯-正丁醇-水（1∶6∶7）组成溶剂系统对人参超声粗提液进行分离，所得溶液用甲醇重结晶，最终得到人参皂苷Re固体，高效液相色谱分析纯度达到98.84%。张敏等[52]以醋酸乙酯-正丁醇-水-醋酸（4∶3∶0.02）作为制备型高速逆流色谱分离的溶剂系统分离人参皂苷，得到Re、Rg1、Rg33种人参皂苷单体化合物，经高效液相色谱检测其纯度均达到95%以上。

绞股蓝皂苷的分离多用大孔树脂和硅胶柱色谱分离，有时候为了得到更纯的单体还要利用ODS硅胶柱进一步纯化，其预处理过程复杂，耗时较长且处理量小，而应用高速逆流色谱粗提物经简单处理后即可直接分离，制备量比传统方法大，纯度也较高。高速逆流色谱也有其不足之处，如溶剂消耗多、检测限较低、灵敏度较差，有时为了提高精度必须与液相色谱联用，且不适合皂苷的大量制备。

2.5 泡沫分离法

泡沫分离技术是通过鼓泡的方式，将粗提液中具有表面活性的物质吸附在气泡表面，随气泡上升过程中得到富集，并带出溶液，达到浓缩纯化的目的[53-54]。绞股蓝皂苷具有亲水性的糖体和疏水性的皂苷元，是一种非离子型表面活性成分，并且具有良好的起泡性，因此完全具备泡沫分离的前提[54]。

修志龙等[55]采用泡沫分离技术，通过改变不同的通气量、料液浓度、pH、进料量以及通气操作方式等因素，发现各因素均对皂苷浓缩的结果均有显著影响，且鼓泡对不同的皂苷单体浓缩作用有明显差异，其中皂苷Rb1、Rb2、Rd有显著的浓缩效果，而Re和Rg1的浓度基本无变化。王琳等[56]利用用泡沫分离法对绞股蓝粗提液中的皂苷进行分离，最佳分离工艺条件下皂苷回收率为49.20%，富集比可达4.51。

泡沫分离在分离纯化绞股蓝皂苷方面还不成熟，泡沫分离设备的性能的改善、多级泡沫分离设备的研制、表面活性剂在气-液界面发生分离的吸附机理以及绞股蓝皂苷的吸附特性还有待于继续深入研究。不可否认的是，随着泡沫分离技术的日益成熟，必将促进其在皂苷浓缩纯化的工业化应用。

3 展望

目前对绞股蓝皂苷的研究多数集中在绞股蓝总皂苷的粗提上，且提取方法多为传统的方法，在超临界萃取和超高压提取方面鲜有研究。后续的绞股蓝皂苷纯化研究相对较少，在新技术的研究及综合运用上明显不足，尤其对某些绞股蓝皂苷单体开展的较少，这严重制约着绞股蓝皂苷的药效研究和绞股蓝产品的竞争力。迄今为止，国内外对绞股蓝皂苷提取、纯化的研究深度明显不够，鉴于绞股蓝独特的生理功效和广阔的市场前景，应加强绞股蓝新工艺提取和分离纯化的研究，以便于深入分析和综合利用绞股蓝。

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Research process in extraction and purification of gypenoside

Gypenoside was main active substance of gynostemma pentaphylla，which had great development value and potential app lication because of its unique function of anti-fatigue，anti-aging，anti-mutagenic，im p roving the immune capacity，regulation of cardiovascular and neurological imp rovement.In this paper，the research p rog ress of gypenosidess was d iscussed from its extraction and purification.It p rovided good c lues and evidence for further study on extraction and purification p rocess of gypenoside.

gypenoside；extraction；purification

TS201.1

A

1002-0306（2014）18-0378-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.077

2013－12－31 *通讯联系人

张新宇（1964-），男，高级工程师，研究方向：食品加工。

安徽省科技计划（1301032155）；国家自然科学基金（31371844，31071556）；国家高技术研究发展计划（2011AA100801）。

ZHANG Xin-yu1，ZHANG Di2，WANG Lin2，XU Zuo-hua1，LIU Kun2，ZENG Qing-mei2，*

（1.Findshe Funland Bio-Pharmaceutical Limited Corporation，Fuyang 236500，China；2.Engineering Research Center of Bio-process，HefeiUniversity of Technology，Hefei230009，China）