桑叶总黄酮不同纯化工艺的比较

林秀仙　罗爱勤　陈亮

[摘要] 目的 比较桑叶总黄酮不同的纯化工艺，为找到一种总黄酮含量>15%，简便可行，廉价且适于生产的纯化工艺。 方法 采用D101型、AB-8型和JD-1型大孔吸附树脂吸附法，乙酸乙酯萃取法，醇提水沉法，醇提-水沉-醇沉法6种方法对桑叶总黄酮进行纯化，以总黄酮的收率和含量为考察指标进行评价。 结果 6种方法制备的总黄酮的百分含量依次为：50.3%、48.5%、55.7%、82.1%、10.8%、18.5%，产品收率依次为：2.37%、2.42%、2.28%、0.45%、18.21%、15.93%。 结论 采用醇提-水沉-醇沉法即可得到符合要求的桑叶总黄酮。

[关键词] 桑叶；总黄酮；纯化工艺

[中图分类号] R284 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（a）-0010-03

桑叶为桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥叶，味甘、苦，性寒，归肺、肝经；具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目的功效；用于风热感冒，肺热燥咳，头昏头痛，目赤昏花等症[1]。桑叶的生物活性物质主要有黄酮类化合物、生物碱、多糖、桑叶蛋白等[2]，其中黄酮类化合物含有桑色素、芸香苷、槲皮素、异槲皮素、紫云英苷等，含量占干叶重的1.0%～3.0%，是植物中茎叶黄酮类化合物含量较高的一种[3]。黄酮类化合物作为桑叶的重要活性成分之一，具有抗氧化、降血压、降血脂、降血糖、防止动脉硬化和抗衰老等功效[4]。桑叶中总黄酮类化合物的常用提取方法是：以浓度约为70%的乙醇为提取溶剂，用浸渍法、超声波法或加热回流法等进行提取[3-7]。本实验以70%乙醇为溶剂，加热回流提取桑叶后，分别考察了不同的纯化工艺，并以总黄酮为考察指标，制备含量达15%以上的桑叶总黄酮，为桑叶总黄酮的进一步开发提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

桑叶（广东广弘药材有限公司，20130701），芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，100080-200707），D101型大孔树脂、AB-8型大孔树脂、JD-1型大孔树脂（净品型，天津农药股份有限公司树脂分公司），95%乙醇（医用级），水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

R-201旋转蒸发仪（上海申科机械研究所），YZG-1000A型真空干燥机（常州市范群干燥设备有限公司），BS210S型电子天平（德国赛多利斯），UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津公司），层析柱（直径2.5 cm×50 cm）。

2 方法与结果

2.1 桑叶总黄酮的纯化方法

2.1.1 桑叶总黄酮的提取 称取桑叶1 kg，加入10倍量70%乙醇，加热回流提取2次，1.5 h/次，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至无乙醇气味，加水稀释至10 L，备用。

2.1.2 D101型树脂吸附法 称取已处理好的D101型树脂50 g，用湿法装柱法装入层析柱（直径2.5 cm×50 cm）中。将“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，加入树脂柱内，控制流速为2～4 ml/min。当溶液全部吸附后，用蒸馏水（3 ml/min）洗脱至流出液无色。再用70%乙醇400 ml洗脱，洗脱速度3～5 ml/min，收集乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，干燥物称重，并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量[8-10]。

2.1.3 AB-8型树脂吸附法 称取已处理好的AB-8型树脂50 g，用湿法装柱法装入层析柱（直径2.5 cm×50 cm）中。将“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，加入树脂柱内，控制流速为2～4 ml/min。当溶液全部吸附后，用蒸馏水（3 ml/min）洗脱至流出液无色。再用70%乙醇400 ml洗脱，洗脱速度3～5 ml/min，收集乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，干燥物称重，并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量。

2.1.4 JD-1型树脂吸附法 称取已处理好的JD-1型树脂50 g，用湿法装柱法装入层析柱（直径2.5 cm×50 cm）中。将“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，加入树脂柱内，控制流速为2～4 ml/min。当溶液全部吸附后，用蒸馏水（3 ml/min）洗脱至流出液无色。再用70%乙醇400 ml洗脱，洗脱速度3～5 ml/min，收集乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，干燥物称重，并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量。

2.1.5 乙酸乙酯萃取法 取“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，减压浓缩成100 ml，置250 ml分液漏斗中，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次用100 ml。合并3次萃取的乙酸乙酯，减压浓缩，转至蒸发皿中，在水浴上将乙酸乙酯挥干，然后真空干燥，得干膏，称重，并用紫外分光光度法测总黄酮的含量。

2.1.6 醇提水沉法 取“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，于4℃冰箱中放置12 h后，取出，滤过，取滤液减压浓缩，真空干燥，得干膏，称重，并用紫外分光光度法测总黄酮的含量。

2.1.7 醇提-水沉-醇沉法 取“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，于4℃冰箱中放置12 h后，取出，滤过，取滤液减压浓缩至25 ml，加乙醇使含醇量达70%，搅拌1 min，再于4℃冰箱中放置12 h后，取出，滤过，取滤液减压浓缩，真空干燥，得干膏，称重，并用紫外分光光度法测总黄酮的含量。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品6.33 mg，加乙醇制成每毫升含芦丁0.2532 mg的溶液，即得。

2.2.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml，分别置25 ml量瓶中，各加水至6 ml，加5%亚硝酸钠溶液1 ml，使混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 ml，摇匀，放置6 min。加氢氧化钠试液10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，应用紫外-可见分光光度法，500 nm波长测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线[1]。

结果表明，芦丁对照品在质量为0.1266～1.5192 mg范围内呈良好的线性关系（表1），得回归方程为Y=0.3943X+0.0195，r=0.9999。

表1 芦丁标准曲线的绘制

2.2.3 样品含量测定结果 称取各工艺制备的桑叶总黄酮1.0 g，置25 ml容量瓶中，加稀乙醇适量，超声处理30 min，冷却后加稀乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至6 ml”起，依法测定吸光度，同时精密量取供试品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为空白溶液。从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的量，计算，即得（表2）。

表2 不同纯化工艺制备的总黄酮收率和含量测定结果

2.2.4 准确度试验 采用加样回收法，取醇提-水沉-醇沉法所得样品（含总黄酮18.5%），称量6份，每份0.5 g，精密称定，分别精密加入芦丁对照品溶液（0.092 89 g/ml）1 ml，分别按“2.2.3”方法操作，测定每份总黄酮含量（表3）。结果表明，回收率均在95%～105%内，RSD=2.34%（<3%），符合方法学要求。

表3 准确度试验的结果

3 讨论

从不同纯化工艺制备的桑叶总黄酮含量的测定结果分析，乙酸乙酯萃取法的纯化效果较好，总黄酮含量最高，但是收率太低，说明大部分黄酮类化合物没被保留下来，这样的工艺和结果在实际生产上不可取；大孔树脂吸附法的总黄酮含量也较高，尤其是D101型和JD-1型大孔树脂，可以使总黄酮含量达50%以上，但是收率较低，且生产工艺复杂，操作繁琐，不符合工艺简便廉价的要求；醇提-水沉-醇沉法，总黄酮含量符合15%以上的要求，收率高，工艺廉价简便，因此更适于实际生产。

此外，本试验还为生产上制备各种含量的桑叶总黄酮提供了一个参考，根据总黄酮的含量需求可选择相应的纯化工艺。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：279，372-373.

[2] 张艳艳，蒲秋燕，黄平，等.秦巴山区桑叶中芦丁提取工艺优化[J].安徽农业科学，2011，39（22）：13372-13373.

[3] 薛淑萍，张立伟.桑叶中总黄酮类化合物的提取工艺的优化[J].中国生化药物杂志，2010，31（6）：405.

[4] 贺伟强，向天勇，陶昆，等.响应面法优化超声辅助提取桑叶总黄酮的工艺研究[J].中国农学通报，2012，28（33）：296-301.

[5] 励建荣，韩晓祥.超高压提取桑叶芦丁[J].分析化学研究简报，2008，36（3）：365-368.

[6] 兰才.桑叶总黄酮提取工艺的优选研究[J].安徽农业科学，2013，41（3）：1260，1280.

[7] 章华伟，陈星宇，凌春英.响应曲面优化醇法提取桑叶黄酮工艺研究[J].氨基酸和生物资源，2010，34（3）：76-79.

[8] 薛淑萍，张立伟.正交实验法纯化桑叶中黄酮类化合物研究[J].山西师范大学学报，2011，25（2）：93-94.

[9] 朱欣婷.大孔树脂纯化桑叶总黄酮的工艺条件研究[J].安徽农业科学，2008，36（26）：11397-11398，11405.

[10] 陈菁菁，李向荣，方晓.大孔吸附树脂分离纯化桑叶总黄酮及其动力学研究[J].浙江大学学报（医学版），2006， 35（2）：219-223.

（收稿日期：2013-11-13 本文编辑：郭静娟）

结果表明，芦丁对照品在质量为0.1266～1.5192 mg范围内呈良好的线性关系（表1），得回归方程为Y=0.3943X+0.0195，r=0.9999。

表1 芦丁标准曲线的绘制

2.2.3 样品含量测定结果 称取各工艺制备的桑叶总黄酮1.0 g，置25 ml容量瓶中，加稀乙醇适量，超声处理30 min，冷却后加稀乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至6 ml”起，依法测定吸光度，同时精密量取供试品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为空白溶液。从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的量，计算，即得（表2）。

表2 不同纯化工艺制备的总黄酮收率和含量测定结果

2.2.4 准确度试验 采用加样回收法，取醇提-水沉-醇沉法所得样品（含总黄酮18.5%），称量6份，每份0.5 g，精密称定，分别精密加入芦丁对照品溶液（0.092 89 g/ml）1 ml，分别按“2.2.3”方法操作，测定每份总黄酮含量（表3）。结果表明，回收率均在95%～105%内，RSD=2.34%（<3%），符合方法学要求。

表3 准确度试验的结果

3 讨论

从不同纯化工艺制备的桑叶总黄酮含量的测定结果分析，乙酸乙酯萃取法的纯化效果较好，总黄酮含量最高，但是收率太低，说明大部分黄酮类化合物没被保留下来，这样的工艺和结果在实际生产上不可取；大孔树脂吸附法的总黄酮含量也较高，尤其是D101型和JD-1型大孔树脂，可以使总黄酮含量达50%以上，但是收率较低，且生产工艺复杂，操作繁琐，不符合工艺简便廉价的要求；醇提-水沉-醇沉法，总黄酮含量符合15%以上的要求，收率高，工艺廉价简便，因此更适于实际生产。

此外，本试验还为生产上制备各种含量的桑叶总黄酮提供了一个参考，根据总黄酮的含量需求可选择相应的纯化工艺。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：279，372-373.

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[7] 章华伟，陈星宇，凌春英.响应曲面优化醇法提取桑叶黄酮工艺研究[J].氨基酸和生物资源，2010，34（3）：76-79.

[8] 薛淑萍，张立伟.正交实验法纯化桑叶中黄酮类化合物研究[J].山西师范大学学报，2011，25（2）：93-94.

[9] 朱欣婷.大孔树脂纯化桑叶总黄酮的工艺条件研究[J].安徽农业科学，2008，36（26）：11397-11398，11405.

[10] 陈菁菁，李向荣，方晓.大孔吸附树脂分离纯化桑叶总黄酮及其动力学研究[J].浙江大学学报（医学版），2006， 35（2）：219-223.

（收稿日期：2013-11-13 本文编辑：郭静娟）

结果表明，芦丁对照品在质量为0.1266～1.5192 mg范围内呈良好的线性关系（表1），得回归方程为Y=0.3943X+0.0195，r=0.9999。

表1 芦丁标准曲线的绘制

2.2.3 样品含量测定结果 称取各工艺制备的桑叶总黄酮1.0 g，置25 ml容量瓶中，加稀乙醇适量，超声处理30 min，冷却后加稀乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至6 ml”起，依法测定吸光度，同时精密量取供试品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为空白溶液。从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的量，计算，即得（表2）。

表2 不同纯化工艺制备的总黄酮收率和含量测定结果

2.2.4 准确度试验 采用加样回收法，取醇提-水沉-醇沉法所得样品（含总黄酮18.5%），称量6份，每份0.5 g，精密称定，分别精密加入芦丁对照品溶液（0.092 89 g/ml）1 ml，分别按“2.2.3”方法操作，测定每份总黄酮含量（表3）。结果表明，回收率均在95%～105%内，RSD=2.34%（<3%），符合方法学要求。

表3 准确度试验的结果

3 讨论

从不同纯化工艺制备的桑叶总黄酮含量的测定结果分析，乙酸乙酯萃取法的纯化效果较好，总黄酮含量最高，但是收率太低，说明大部分黄酮类化合物没被保留下来，这样的工艺和结果在实际生产上不可取；大孔树脂吸附法的总黄酮含量也较高，尤其是D101型和JD-1型大孔树脂，可以使总黄酮含量达50%以上，但是收率较低，且生产工艺复杂，操作繁琐，不符合工艺简便廉价的要求；醇提-水沉-醇沉法，总黄酮含量符合15%以上的要求，收率高，工艺廉价简便，因此更适于实际生产。

此外，本试验还为生产上制备各种含量的桑叶总黄酮提供了一个参考，根据总黄酮的含量需求可选择相应的纯化工艺。

[参考文献]

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[2] 张艳艳，蒲秋燕，黄平，等.秦巴山区桑叶中芦丁提取工艺优化[J].安徽农业科学，2011，39（22）：13372-13373.

[3] 薛淑萍，张立伟.桑叶中总黄酮类化合物的提取工艺的优化[J].中国生化药物杂志，2010，31（6）：405.

[4] 贺伟强，向天勇，陶昆，等.响应面法优化超声辅助提取桑叶总黄酮的工艺研究[J].中国农学通报，2012，28（33）：296-301.

[5] 励建荣，韩晓祥.超高压提取桑叶芦丁[J].分析化学研究简报，2008，36（3）：365-368.

[6] 兰才.桑叶总黄酮提取工艺的优选研究[J].安徽农业科学，2013，41（3）：1260，1280.

[7] 章华伟，陈星宇，凌春英.响应曲面优化醇法提取桑叶黄酮工艺研究[J].氨基酸和生物资源，2010，34（3）：76-79.

[8] 薛淑萍，张立伟.正交实验法纯化桑叶中黄酮类化合物研究[J].山西师范大学学报，2011，25（2）：93-94.

[9] 朱欣婷.大孔树脂纯化桑叶总黄酮的工艺条件研究[J].安徽农业科学，2008，36（26）：11397-11398，11405.

[10] 陈菁菁，李向荣，方晓.大孔吸附树脂分离纯化桑叶总黄酮及其动力学研究[J].浙江大学学报（医学版），2006， 35（2）：219-223.

（收稿日期：2013-11-13 本文编辑：郭静娟）