阿尔茨海默病患者脑内p75神经营养因子受体(p75NTR)的表达及与老年斑位置关系的研究

王叶冉，刘雨辉，梁春荣，曾凡，卜先乐，矫树生，王庆华，姚秀卿，周华东，王延江

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种以皮质、海马神经元丢失，淀粉样β蛋白(amyloid β-protein，Aβ)聚集形成老年斑以及Tau蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠结为主要病理改变的中枢神经系统变性疾病，是最常见的痴呆类型，临床主要表现为进行性的认知功能减退，尤其是记忆力下降。p75神经营养因子受体(p75neurotrophin receptor，p75NTR)是脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)等神经营养因子的受体，是在神经系统发育过程中调控神经元存活与死亡的重要分子。正常成年人脑内p75NTR表达水平很低且主要表达于基底前脑的胆碱能神经元。研究发现，p75NTR也是Aβ的受体，介导Aβ的神经毒性作用，从而引起神经轴突变性和死亡[1]。本研究小组发现，p75NTR在AD转基因小鼠(APPswe/PS1dE9)脑内表达增高并参与了Aβ沉积的调控[2]。本研究探讨p75NTR在AD患者脑内的表达及其与老年斑的空间位置关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 雄性APPswe/PS1dE9双转基因小鼠来自美国Jackson动物中心，该小鼠携带人致病型淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)和早老素1(presenilin-1，PS1)基因，12月龄相当于AD晚期，以同窝野生型雄性小鼠作为对照。本研究采用的AD患者(4例)和同龄认知功能正常对照(4例)人脑标本由美国Banner Sun Health Institute脑库提供。本研究人体组织相关研究的临床试验注册号为ChiCTR-OCC-12001966。

1.2 实验取材 12月龄雄性APPswe/PS1dE9小鼠及同窝雄性野生型小鼠10只，用0.08g/kg戊巴比妥钠深度麻醉，打开胸腔，从心尖灌注含0.5%NaNO2的磷酸盐缓冲液100ml，取出大脑，左大脑半球液氮速冻，用含蛋白酶抑制剂的SDS制成匀浆，用于后续Western blotting检测，右大脑半球置入4%多聚甲醛固定。

1.3 免疫组织化学染色检测p75NTR的表达 兔源多克隆抗p75NTR抗体(Ab9650)由美国New York大学M. Chao教授提供。石蜡包埋组织块切片烤干后经二甲苯脱水，0.5%H2O2室温孵育10min灭活内源性过氧化物酶，甲酸联合EDTA进行抗原修复，30%马血清封闭非特异性抗原，与1:500稀释的p75NTR抗体反应，4℃过夜。洗膜3次，加入1:2000稀释的生物素标记的鼠抗兔二抗，室温孵育1h，漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素室温下孵育1h，洗膜3次，以DAB为底物显色，经苏木精复染后进行常规脱水、封片。Olympus显微镜观察，在光强度和聚光器设置保持不变的条件下摄片。用Image J软件定量分析AD患者脑内p75NTR的表达情况。

1.4 Western blotting检测p75NTR的表达 将脑匀浆离心后取上清，以SDS-PAGE凝胶行蛋白电泳，电泳完毕将蛋白转至PVDF上。转膜后在含5%脱脂奶粉的TBST中封闭1h，TBST洗涤3次，与1:1000稀释的p75NTR抗体及β-actin抗体反应，4℃过夜。洗膜3次，加1:5000稀释的二抗，室温孵育1h，ECL化学发光法显色，用Image J 软件分析各条带光密度值。

1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量数据以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 海马部位神经元与神经纤维p75NTR的表达AD患者海马部位可见增粗变性的p75NTR阳性神经纤维末梢，主要位于老年斑的中心部位(图1A)，而在认知功能正常的对照者海马内未见增粗变性的神经末梢。在APPswe/PS1dE9转基因小鼠海马内也存在类似的增粗变性的神经末梢(图1D)，而野生型小鼠海马内未见增粗变性的神经末梢。AD患者和认知正常对照者的海马中可见深染的p75NTR阳性神经纤维(图1B、E)。在12月龄APPswe/PS1dE9小鼠海马内可见增粗的p75NTR阳性神经纤维，而野生型小鼠未见阳性神经纤维(图1C、F)。在AD患者和认知正常者的海马内可见p75NTR阳性的神经元，而12月龄APPswe/PS1dE9小鼠和同龄野生型小鼠海马内未见p75NTR阳性的神经元(图2)。

2.2 海马组织匀浆p75NTR表达水平检测 Western blotting检测显示，在人和小鼠海马组织匀浆中均存在p75NTR表达，其中AD患者表达水平显著高于认知正常对照者，12月龄APPswe/PS1dE9小鼠表达水平显著高于同龄野生型小鼠，表明AD患者和APPswe/PS1dE9小鼠脑内p75NTR表达水平增高(图2)。

3 讨 论

p75NTR参与多种神经营养因子的信号传导，其生理功能取决于所结合的配体和协同受体[1,3-4]。P75NTR与各种神经营养因子及其前体结合参与了多种生理病理过程，与NGF、BDNF、神经营养因子3(neurotrophin-3，NT-3)及NT-4/5结合可以促进神经元的存活，而与它们的前体pro-NGF、pro-BDNF、pro-NT3相互作用可引起神经元的凋亡[5-9]。p75NTR也是Aβ受体，在AD的发生过程中介导Aβ的神经毒性作用，导致神经元凋亡和神经纤维变性[1,10]。我们前期研究发现，p75NTR还具有促进Aβ生成和调控Aβ沉积的作用[2]。因此p75NTR在AD发生过程中参与了Aβ生成、沉积和神经毒性等方面的调控，是AD病理过程中的一个重要受体。

图1 海马部位神经纤维p75NTR的表达及其与老年斑的位置关系(DAB ×400)Fig.1p75NTR expression on neurofibrils in hippocampus and its spatial distribution in relation to amyloid plaque (DAB ×400)

图2 p75NTR在海马神经元的表达Fig.2Neuronal expression of p75NTR in hippocampus

本研究发现，AD患者和认知正常对照者海马内均存在表达p75NTR的神经纤维，并观察了AD患者脑内p75NTR阳性神经纤维与老年斑的关系，发现与APPswe/PS1dE9小鼠一样，AD患者海马中变性的p75NTR阳性神经纤维也位于老年斑中心部位。这一现象支持我们既往在动物模型中提出的p75NTR阳性的变性神经纤维可能参与了老年斑形成的假说[2]。

关于p75NTR在AD条件下的表达是增高还是降低，目前尚无定论。p75NTR主要表达于基底前脑的胆碱能神经元及其轴突，由于这些胆碱能神经元在AD脑内死亡最多，因此以往许多研究认为p75NTR在AD脑内的表达应该是降低的[1,11-13]。在本研究中，我们同时将AD患者和APPswe/PS1dE9小鼠脑组织与正常对照比较，结果均表明AD脑内p75NTR表达水平显著高于对照，表明AD条件下脑内p75NTR的表达水平是增高的。可溶性的Aβ含量在AD起病早期增加[14]，我们推测可能Aβ与p75NTR的结合抑制了p75NTR的降解，从而提高了p75NTR的水平，也可能是Aβ与p75NTR结合本身作为一种信号促进了p75NTR自身基因的转录及蛋白表达。最近的研究表明，Aβ可引起人神经母细胞瘤细胞SKSY5Y中p75NTR的表达增加[15]，类胰岛素生长因子1受体(insulin-like growth factor 1receptor，IGF-1R)信号通路参与了Aβ对p75NTR表达的上调作用[16]。

虽然大多数证据表明Aβ是AD的核心致病物质，但在各种APP转基因小鼠模型中，尽管脑内出现Aβ过度产生和老年斑形成，却并无明显的神经元丢失和脑萎缩[17]。对于这一现象目前尚无合理解释。本研究发现在人(AD患者和认知正常对照者)海马神经元上p75NTR表达明显，而老龄APPswe/PS1dE9及野生型小鼠海马神经元未见明显p75NTR表达。这一人与小鼠的差异现象对于解释AD动物模型和AD患者神经元死亡及脑萎缩方面的差异具有重要的意义。由于p75NTR是Aβ的受体，介导Aβ引起的神经元变性死亡，人脑神经元表达较高水平的p75NTR，而小鼠脑内神经元p75NTR表达水平低，提示人脑神经元可能比小鼠神经元对Aβ的神经毒性更为敏感，从而在AD患者脑内出现大量神经元死亡和脑萎缩，而过表达Aβ的转基因AD动物无明显神经元死亡和脑萎缩。

最近有研究报道体外培养的基底前脑神经元中p75NTR能够介导Aβ的内吞及其在溶酶体的降解[18]，提示p75NTR在Aβ的中枢清除机制中具有重要的作用。Aβ是AD的核心致病物质，p75NTR参与了Aβ的生成、沉积、降解、清除及神经毒性作用，在AD的发生发展中具有重要作用，可能成为一个新的AD治疗靶点。

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