精神分裂症患者血浆miRNA表达水平与精神症状的关系研究

宋红涛，过伟，孙欣羊，张梁，赵林，钟爱芳，牛威，戴运华，张理义，卢正斌

miRNA是一类长度在22nt左右，能够调控编码区蛋白表达水平的内源性小分子RNA[1]。miRNA通过与目标mRNA互补配对，在转录后水平对基因表达进行负调控，导致目标mRNA降解或翻译抑制：当miRNA与mRNA不完全互补时，将导致翻译抑制；当miRNA与mRNA完全互补时，则导致目标mRNA降解[2]。单个miRNA分子能够调节几百个基因位点，而miRNA的整体网络则可调节50%～60%的转录过程[3]。miRNA凭借其在转录后水平对基因表达的调控，在机体生物信息网络中扮演着重要角色，与多种精神疾病的发生发展有着密切联系[4]。病例对照研究证实，精神分裂症患者体内存在多种miRNA的表达异常[5]，miRNA调控多种精神分裂症的易感基因，与精神分裂症的发生发展存在明显关联[6]。目前精神疾病的诊断主要以症状学为标准，精神分裂症患者血浆中miRNA的表达水平与其精神症状的相关性鲜见报道。本研究在详细查阅国内外文献的基础上，结合生物信息学技术(miRNA靶基因预测软件，如TargetScan、miRanda、miRbase等)，选择9种在精神分裂症患者体内差异表达显著的miRNA(miR-30e、miR-34a、miR-181b、miR-195、miR-346、miR-432、miR-7、miR-132、miR-212)进行分析，探讨其与精神症状的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2012年7月－2013年5月解放军102医院精神科门诊收治的精神分裂症患者。入组标准：①符合美国精神疾病诊断和统计手册第4版(DSM-Ⅳ)精神分裂症诊断标准；②首发病例或入组前3个月未服用抗精神病药物；③年龄15～60岁。排除标准：①患有其他精神疾病；②患有脑外伤等躯体或神经系统疾病；③有酗酒或药物滥用史；④入组前1个月内有输血史；⑤入组前3个月内使用过无抽搐电休克治疗(MECT)。共入组53例患者，其中男28例，女25例，年龄15～56(27.5±10.8)岁。本研究获得解放军102医院医学伦理委员会批准，所有受试者或受试家属(监护人)均签署知情同意书。

1.2 阳性和阴性症状量表(PANSS)[7]评估 PANSS由阳性量表7项(P1-P7)、阴性量表7项(N1-N7)和一般精神病理量表16项(G1-G16)，附加3个评定攻击危险性的补充项目(S1-S3)组成，包括反应缺乏、思维障碍、激活性、偏执、抑郁和补充(攻击性)6个症状群。每个项目按其精神病理水平递增的7级评分为：1-无，2-很轻，3-轻度，4-中度，5-偏重，6-重度，7-极重度。

1.3 主要试剂及仪器 miRNeasy血清/血浆提取试剂盒、miRNeasy血清/血浆外参(德国Qiagen公司)；TaqMan MicroRNA Assays、TaqMan通用混合试剂盒Ⅱ、TaqMan MicroRNA反转录试剂盒(美国ABI公司)。ABI 9700型PCR仪、ABI 7900HT Fast Read-Time PCR System(美国ABI公司)；天美CT14RD型台式高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)；NanoDrop1000超微量紫外分光光度计(美国Thermo公司)；WH-2微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；JS-400A恒温金属浴(上海培清科技有限公司)；DK-8D数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台(苏净净化设备有限公司)；－80℃超低温冰箱(日本三洋公司)；Eppendorf移液枪(德国Eppendorf公司)；Andy Bio掌上离心机(美国Andy Bio公司)。

1.4 总RNA抽提与荧光定量PCR反应 所有被试者均于用药前使用EDTA抗凝管采集肘静脉血5ml，室温下(15～20℃)离心，将取得的血浆置于－80℃冰箱保存备用。按照miRNeasy血浆提取试剂盒说明书从血浆中提取总RNA，为了避免抽提步骤导致RNA的含量误差，加入miR-39血浆外参试剂盒进行校正[8-9]。依照TaqMan microRNA反转录试剂盒说明书进行反转录，按照TaqMan通用混合试剂盒Ⅱ说明书进行实时荧光定量PCR反应，通过ABI 7900型PCR仪测定Ct值，每个反应重复2次。以miRNA与外参miR-39[8-9]之间Ct值的差值(ΔCt)表示miRNA的相对表达水平。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，采用Pearson相关分析、独立样本t检验、多元逐步回归分析miRNA和精神症状的关系，所有统计分析均为双侧显著性检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 精神分裂症患者血浆中miRNA表达水平与各症状群及量表总分的相关性分析 Pearson相关分析显示，miR-346的表达水平与一般精神病理总分呈显著负相关(r=–0.282，P＜0.05)；miR-34a的表达水平与激活性症状群和攻击性症状群呈显著负相关(r=–0.345，r=–0.284，P＜0.05)，余miRNA表达水平与各症状群及量表总分无明显相关性(P＞0.05)。

2.2 miR-34a和miR-346高表达组、低表达组各症状群及量表总分比较 求出研究对象miR-34a和miR-346表达水平的四分位数，将miR-34a和miR-346的表达水平低于或等于第一四分位数(QL=P25)者分别归为miR-34a、miR-346低表达组，高于或等于第三四分位数(QU=P75)者分别归为miR-34a、miR-346高表达组，对高表达组和低表达组的各症状群及量表总分进行比较，结果显示，miR-34a高表达组的激活性症状群和攻击性症状群分值低于低表达组，miR-346高表达组反应缺乏症状群分值低于低表达组，差异有统计学意义(表1)。

2.3 miRNA对精神症状群影响的逐步回归分析以miRNA表达水平为自变量，以一般精神病理总分、反应缺乏症状群、激活性症状群和攻击性症状群为因变量进行逐步回归分析(自变量选入标准为0.05，剔除标准为0.10)，结果显示，miR-346进入以一般精神病理为因变量的回归方程，可解释一般精神病理变异的6.1%，miR-34a分别进入以激活性症状群和攻击性症状群为因变量的回归方程，分别可解释激活性症状变异的10.2%、攻击性症状群变异的6.3%(表2)。

表1 miR-34a和miR-346高表达组、低表达组各症状群及量表总分比较的(n=13)Tab. 1Comparison of syndrome scores and total score in miR-34a and miR-346high- and low-expression groups (n=13)

表2 miRNA对精神症状群影响的逐步回归分析Tab. 2Stepwise regression analysis of the effects of miRNA expression on mental syndromes

3 讨 论

迄今为止，研究者相继在植物、动物和微生物中发现了大量的miRNA分子，并且数量在不断更新。据计算机推测，人类基因组可能存在1000多个miRNA基因，单个miRNA可调控200多个靶基因，miRNA对60%以上的基因起调控作用，在转录后水平能够精确调控30%以上蛋白质编码基因的表达[10]，这使得miRNA成为最大的一类基因表达调控因子。miRNA具有较强的发育时序特异性和组织特异性[11-12]，在中枢神经系统的发育和神经元的分化过程中起着十分重要的作用[13-15]。miRNA不仅参与多种神经功能的调节[16]，还与突触可塑性有关[17]。在脑皮质发育时，一些miRNA的表达会随着皮质形成过程中的细胞增殖、区域性分化和传导通路的建立而发生变化[18]，对大脑的发育和功能调节起至关重要的作用[19]。

有研究证实，miRNA的表达和调控异常与精神分裂症的发生发展有着密切联系。Kim等[20]研究发现，与对照组比较，精神分裂症组有7个miRNA(miR-7、miR-34a、miR-132、miR-132*、miR-154*、miR-212和miR-544)表达有升高。Lai等[21]研究发现，精神分裂症患者外周血中有7个miRNA表达存在异常(hsa-miR-34a、miR-449a、miR-564、miR-548d、miR-572、miR-652上调，miR-432下调)，其中一部分与精神分裂症患者的阴性症状、神经认知功能障碍和错配消极表现呈显著相关。作为精神疾病诊断标准的DSM-Ⅳ和CCMD-Ⅲ主要以症状学为诊断依据，而随着研究的不断深入，越来越多的证据显示，精神分裂症可能与miRNA的表达异常有关，但精神分裂症患者体内miRNA的表达水平与其精神症状的关系却研究甚少。

文献报道，miR-34a可能参与精神分裂症的发病过程[20-21]。本研究结果显示，miR-34a与精神分裂症患者的激活性症状群及攻击性症状群有明显关联，血浆miR-34a表达水平能够预测患者10.2%的激活性症状群和6.3%的攻击性症状群，提示miR-34a可能在精神分裂症患者的激活性症状群和攻击性症状群的发生发展中起重要作用，但具体机制有待进一步研究。编码miR-346的基因位于离子型谷氨酸受体Δ1(GRID1)的内含子2上，Zhu等[6]研究发现，精神分裂症患者体内miR-346和GRID1的表达量均低于正常对照者。本研究结果显示，miR-346与精神分裂症患者的一般精神病理症状有明显关联，血浆miR-346表达水平能够预测患者6.1%的一般精神病理症状。

综上所述，精神分裂症患者体内miRNA表达异常与精神分裂症的发病有明显关联。精神分裂症患者血浆中miR-34a的表达水平与激活性症状群和攻击性症状群有明显关联，miR-346的表达水平与一般精神病理症状有明显关联。miR-34a和miR-346可能在上述精神症状的发生发展过程中扮演着重要的角色，但其具体作用机制有待进一步深入研究。

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