粒细胞集落刺激因子对高脂喂养兔动脉粥样硬化形成的影响及机制初探

胡朝晖，马晓萍，李元民，李 磊，刘如辉，徐文俊，杨 茗，蒋金法.同济大学附属同济医院心内科，上海 00065；.复旦大学附属中山医院眼科，上海 000；.泰山医学院附属医院心内科，泰安 7000

·论著·

粒细胞集落刺激因子对高脂喂养兔动脉粥样硬化形成的影响及机制初探

胡朝晖1，马晓萍2，李元民3，李 磊2，刘如辉1，徐文俊1，杨 茗2，蒋金法1
1.同济大学附属同济医院心内科，上海 200065；
2.复旦大学附属中山医院眼科，上海 200032；
3.泰山医学院附属医院心内科，泰安 271000

目的观察粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对动脉粥样硬化形成的影响，并对其机制进行初步探讨，为临床提供参考。方法将30只新西兰雄性健康大白兔随机分为对照组6只，高脂喂养组、普通及高脂喂养＋G-CSF组各8只，4组动物每周采血，监测总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）等各项血脂指标动态变化。取材后用苏丹Ⅲ染色观察脂肪斑块面积，苏木精-伊红（HE）染色观察内膜厚度等形态学变化。免疫组化观察基质金属蛋白酶（MMP）9及其抑制物（TIMP-2）的表达。并用Leica QwinV3图像分析系统计算阳性率等相关指标。扫描电镜观察内皮及脂肪细胞的组间差异。结果高脂喂养能使TC、LDL等血脂水平上升，6周后高峰，与对照相比，P＜0.05，但8周后就趋于稳定。加G-CSF使血脂高峰前移，使TC、LDL等提前2周就与对照组出现统计差异(P＜0.05)，并有双峰样改变，但对TG同样无影响。普通喂养＋G-CSF能使血脂有所波动，但尚不足以达到显著差异。病理分析发现G-CSF能使斑块面积、内膜厚度、MMP/TIMP表达均增加，但后二者并未达到统计学差异（P＞0.05）。扫描电镜支持上述发现。结论 G-CSF对血脂存在一定影响，且以TC、LDL为主，对TG作用不大。因此它可使动脉粥样硬化恶化，具体表现为斑块面积的扩大，内膜厚度增加，机制可能与其对基质的影响有关，但尚需进步研究证实。

动脉粥样硬化；高脂喂养；粒细胞集落刺激因子；兔

粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是广泛应用于放疗和化疗患者动员干祖细胞支持造血恢复的细胞因子，近来研究表明，在心肌梗死后用G-CSF可动员骨髓干细胞进入循环，迁移到心肌梗死部位而促使心肌再生和血管新生，而改善心脏功能[1]。目前，G-CSF治疗心肌梗死的实验性研究已很多，并进入临床试验阶段。但由于具体机制不明，对于动脉粥样硬化，G-CSF具备怎样的影响，国内外学术界尚无定论。因为大多数心肌梗死患者均存在程度不同的动脉粥样硬化，所以系统地研究G-CSF在动脉粥样硬化中的作用，以求最大效能地发挥其良好效应，防止不良作用，这具有很大的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

重组G-CSF购自上海三维生物技术有限公司；日立7170全自动生化分析仪检测总胆固醇三酰（TC）、甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）等指标；常规病理分析及免疫组化在上海市心血管病研究所病理实验室完成；基质金属蛋白酶9(MMP-9)抗体购自密理博公司(CHEMICON MAB3309)，基质金属蛋白酶抑制物2(TIMP-2)抗体购自Thermo公司(Clone3A4)，免疫组化SABC试剂盒购自上海晶美生物公司；电镜标本制作及扫描观察在复旦大学医学院电镜室完成。

1.2 方法

1.2.1 动物及分组

30只体质量为2.0～2.5 kg的雄性新西兰大白兔，随机抽取24只等分为3组：普通喂养＋G-CSF组、高脂喂养组、高脂喂养＋G-CSF组，按文献严格配制高脂饲料喂养[2]。另6只设为对照组，普通喂养，仅在相应时间点采血标本及取材做对照。

1.2.2 给药

适应性喂养1周后，对照及高脂喂养组用0.5 ml生理盐水，普通及高脂喂养＋G-CSF组予以10 μg/kg G-CSF用生理盐水稀释成0.5 ml，每日皮下注射，连续5日，隔周进行。共4次。

1.2.3 血脂测定

每周测量4组（血浆TC、TG、LDL、HDL）。采用公式计算动脉粥样硬化指数（AI）=(TC－HDL)/ HDL[3]。

1.2.4 病理分析

10周后处死动物取材，以病变可能最严重的胸主动脉为主要研究对象：（1）苏丹Ⅲ脂肪染色：取下约2 cm胸主动脉，常规10%中性甲醛固定及染色处理后，用大头针展平在平面上数码拍照，应用leica Qwin V3图片分析系统（色差标记二进制编辑法）计算动脉脂肪斑块面积比；（2）常规苏木精-伊红（HE）染色：同样部位组织取约0.7 cm石蜡包埋，切片染色后，显微镜下观察管腔形态变化，同样用上述系统测量距离，分析内膜厚度及其占管腔比；（3）免疫组化：采用SP法，DAB显色，上述图像分析系统计算MMP9及TIMP2阳性率。

1.2.5 扫描电镜观察

在4组相同部位取下胸主动脉组织，迅速生理盐水漂洗，铺平，用锋利刀片制作成0.5 mm2平面尽快置入戊二醛电镜固定液送检，处理后扫描观察标本的内皮细胞及泡沫细胞、脂肪斑块的形态变化。

1.3 统计学处理

2 结果

实验期间8只兔子死亡：对照组1只、高脂喂养组2只、高脂喂养＋G-CSF组3只，普通喂养＋GCSF组2只，最终各组分别存活有5、6、5、6只动物，达到完成实验要求。

2.1 血脂及动脉粥样硬化指数的动态变化

分析发现，动脉粥样硬化形成过程中各项血脂指标以TC、LDL、HDL上升为主，TG基本不受影响。高脂喂养＋G-CSF组上升更快（图1），第3周始TC、LDL与对照组相比达到统计学差异，第4周动脉粥样硬化指数、HDL与对照组相比也开始有显著差异（P＜0.05），见表1。而高脂喂养组则上升较为平缓，第6周开始才有统计学差异。其中高脂喂养＋G-CSF组出现2个高峰；但高脂喂养组血脂水平均为7周达到最高峰，8周后逐步进入稳定期，见表2。虽然高脂喂养＋G-CSF组TC、LDL等指标均高于高脂喂养组，但此2组间相比并无统计学差异（P＞0.05），这可能与样本量减少有关。而普通喂养＋G-CSF虽然使各项血脂水平有所波动，尤其在4周似显上升，但与对照相比，并无统计差异。而对照组各血脂水平基本平稳，无显著变化。

图1 各组血脂动态变化折线图Fig.1 The dynamic change of blood lipid in 4 groups

表1 斑块面积、内膜厚度、MMP-9/TIMP-2阳性率的对比Tab.1 The contrast of plaque area，thickness of intima，positive rate of MMP-9 and TIMP-2

表2 4组不同时间点动脉粥样硬化指数的变化Tab.2 The changes of atherosclerosis index during different time in 4 groups

2.2 病理分析

高脂喂养2月后，兔胸主动脉均可形成明显的动脉粥样硬化脂肪斑块，与对照组相比，有统计学差异（P＜0.05）。其中高脂喂养＋G-CSF组更为显著，且与高脂喂养组也达到统计学差异(P＜0.01)。二者的内膜厚度也较正常对照相比明显增厚，其中高脂喂养＋G-CSF组达到统计学差异（P＜0.05）。MMP-9及TIMP-2在正常血管组织中均很少表达，随着动脉粥样硬化的形成，两者表达量上升，以高脂喂养＋G-CSF组更明显，并出现比例的失调。但高脂喂养＋G-CSF组与高脂喂养组之间差异并未达到显著的统计学意义(P＞0.05)。但即使普通喂养，加用G-CSF能使内膜增厚，MMP9及TIMP2的

表达均升高，与对照相比，后者达到统计学差异（P＜0.05），病理标本见图2～图5。

2.3 扫描电镜观察胸主动脉内皮细胞及脂肪斑块

扫描电镜镜下可见对照组动脉表面基本光滑，内皮细胞形态规则，分布平整，无明显脂肪浸润迹象。加G-CSF后内膜略显增厚，表面粗糙，凹凸不平，但未见明显斑块及脂滴。而高脂喂养后内膜变得粗糙，内皮细胞变形，出现脂滴样变化，并有少量凋亡，可见细胞碎片。加用G-CSF后病变更加显著，内膜表面凹凸不平，出现大块斑块，内皮细胞出现缠绕、扭曲，大片细胞死亡，组织碎片杂乱无章（图6）。

图2 胸主动脉（苏丹Ⅲ染色×200）Fig.2 SudaneseⅢfat dye of aorta thoracicalis（×200）

图3 胸主动脉（HE染色×200）Fig.3 HE staining of aorta thoracicalis（×200）

图4 MMP9免疫组化Fig.4 IHC of MMP-9

图5 TIMP2免疫组化Fig.5 IHC of TIMP-2

图6 胸主动脉扫描电镜（×500）Fig.6 Scanning electron microscope of aorta thoracicalis（×500）

3 讨论

近年来，随着干细胞移植治疗心肌梗死等相关研究的逐步深入，人们发现单用干细胞动员剂如G-CSF也能达到类似疗效。越来越多的研究发现G-CSF不仅对急性心肌梗死具良好的治疗作用，对于慢性缺血性心脏病也能起到很好的心脏保护效应[4]。可以想象，未来G-CSF在心血管领域必然得到更加广泛的应用。但其毕竟是具备多种效应的细胞因子，除导致白细胞增多、引起高黏滞血症外，还对凝血、抗凝血系统有较大影响，引起高凝状态。这一作用可能与G-CSF引起的应激状态有关[5]。如有学者在急性或陈旧性心肌梗死患者皮下注射G-CSF 4 d后行PCI治疗，支架内再狭窄率明显增高，不得不中断试验[6]。由此我们必须注意到，GCSF作用于心脏的同时，必然对全身循环系统产生作用，尤其是与心血管疾病密切相关的动脉。而绝大多数缺血性心脏病患者，往往伴随动脉粥样硬化，这不得不引起警惕。

G-CSF对动脉粥样硬化的作用，由于具体机制不明，争议很多。Hasegawa等[7]研究了两种兔的动脉粥样硬化模型(自发型及球囊扩张后诱发型)，并分别给予G-CSF处理，对照组给予生理盐水，结果显示G-CSF明显促进了损伤血管的再内皮化，阻止了新生内膜与中膜比率的增加。这说明G-CSF对动脉粥样硬化具有治疗潜力。但是，Haghighat等[8]对ApoE基因敲除小鼠进行研究，分别给予G-CSF及GM-CSF处理，对照组给予NS，结果发现动脉粥样硬化反而恶化，但这种恶化并未伴随炎症因子及炎症基因的过度表达。为此他们提出G-CSF或GM-CSF对动脉粥样硬化并无益处，而有不良作用。国内赵文燕等[9]应用新西兰雄性大白兔作的实验得出结论则认为动脉粥样硬化损害内皮，减少内皮祖细胞（EPC），G-CSF对EPC有动员作用，能够增加外周血EPC数量，对血管有保护作用，抑制动脉粥样硬化进展。我们的研究发现G-CSF并未达到上述治疗作用，反而使斑块面积加大，内膜增厚，内皮细胞变形，凋亡增加。这可能与用药剂量及给药方式有关。间隔使用G-CSF使机体一直处于应激状态，其产生的有害作用反而超过了促EPC增殖的益处。而中低剂量连续使用机体可能迅速适应，其增加EPC数量，保护内皮，刺激血管新生的良好作用就掩盖了上述可能的不良反应。另外，物种的差异也可能是动物实验结果截然不同的一个重要原因。有关机制需要进一步研究证实。

血脂异常是动脉粥样硬化形成因素中的重要一项，参与动脉粥样硬化发病的多个环节，机制复杂。一般人们认为G-CSF是骨髓干细胞的强有力的动员剂，与各项血脂水平并无关系。但我们的研究发现，应用G-CSF可以使动脉粥样硬化过程中最重要的血脂指标TC与LDL高峰提前，并出现双峰样改变，而单高脂喂养须历时6周以上才使这2项指标以及AI与正常对照具有统计学差异。G-CSF整整使之提前2周，但8周以后两组均进入平台期，这可能与动脉粥样硬化已经形成有关。众所周知，高脂血症能够损害EPC，进而影响内皮细胞并导致其功能障碍，从而诱发血管病变，其中恰恰是TC、LDL扮演重要角色。我们发现此过程中TG并无明显变化，这正证明了我们的观点，即G-CSF对血脂存在一定影响，且以TC、LDL为主，对TG作用不大。G-CSF对动脉粥样硬化可能的恶化作用，也许就与刺激TC、LDL等有害因子分泌有关。G-CSF应用不当可以加速动脉粥样硬化的形成，但单用GCSF并未能对血脂造成显著影响，说明造成血脂异常的主要因素还在高脂喂养，G-CSF只有在此基础

上才能发挥作用。这提示我们对血脂尚正常的年轻患者，G-CSF可能还是安全的。

血管基质的变化与动脉粥样硬化有重要关系，如Feldman等[10]很早就发现在高脂喂养兔中支架置入与球囊扩张可以引起MMP表达差异。同时有实验也已证实G-CSF对MMP存在较大作用[11-12]，那么G-CSF是否通过对基质的影响参与AS的形成，对此我们进行了初步探讨。由于实验方法的局限及样本量的关系，我们采用免疫组化分析，发现GCSF能引起基质金属蛋白酶的变化，但两高脂喂养组之间差异并未达到显著统计学意义。这有待于我们在下一步的实验中扩大样本量，应用免疫印迹、PCR等分子生物学方法进步证实。

总之，对于G-CSF在动脉粥样硬化等血管性疾病中的研究，今天还只是开头，还有很多机制方面的问题需要人们去深入了解。随着它在心血管疾病中的逐步应用，这项任务就更显紧迫与艰巨。

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The influence on atherosclerosis of hyperglycemia rabbit by G-CSF

HU Zhaohui1，MA Xiaoping2，LI Yuanmin3，LI Lei2，LIU Ruhui1，XU Wenjun1，YANG Ming1，JIANG Jinfa1
1.Department of Cardiology，Tongji Hospital，Tongji University School of Medicine，Tongji University，Shanghai 200065，China；
2.Department of Ophthalmology，Zhongshan Hospital of Fudan University，Shanghai 200032，China；
3.Department Cardiovascular，Affiliated Hospital of Taishan Medical College，Tan'an 271000，China

Objective Inorder to give reference for clinic application，we investigated the influence on atherosclerosis of hyperglycemia rabbit by granulocyto colony-stimulating factor（G-CSF）.MethodsThirty New Zeeland healthy male rabbits were divided into 4 groups randomly，whose blood was drew from the ear vein weekly to test the change of total cholesterol（TC），triglyceride（TG），high density lipoprotein（HDL），low density lipoprotein（LDL）.After sacrifice，the aorta thoracicalis was taken to make the SudaneseⅢfat dye，conventional hematoxylin and eosin（HE）dye as well as scanning electron microscope to observate the form change of endothelial cells，gruel type mottling and fat foam.Meanwhile immunohisto chemical IHC of matrix metallopeptidase 9（MMP9）and tissue inhibitor of metalloproteinase 2（TIMP2）was used to explorate the maitrix，and many datas of pathology were calculated by Leica QwinV3 image analysis system.Results Fed with high fat food，the level of blood fat such as TC，LDL and so on can rise to peak in 6 weeks，then go down to stable platform period after 8 week.G-CSF can make the fat curve appear double-peak，and the statistics difference of TC，LDL arrives 2 weeks earlier，contrast to the control group(P＜0.05).But it had no effect on TG.Adding G-CSF to ordinary fed group can make those blood fat have some fluctuation but can't get the significant deviation.The analysis by pathology also found G-CSF can increase the plaque area，endomembrane thickness，and the express of MMP9/ TIMP2.However only the former index won statistics significance between the 2 groups fed with fat.The scans electron microscope found the fragments of endothelial cell increases obviously when atherosclerosis appeared，shrinks in shape，so the same point was surported.Conclusion G-CSF has certain effect on the endothelial cell shape，and stimulate the blood fats level，primarily TC，LDL.For this reason it can aggravate atherosclerosis.The mechanism maybe related to maitrix but need further verification.

Atherosclerosis；High fat feed；G-CSF；Rabbit

R541

A

2095-378X（2014）04-0230-06

胡朝晖(1975—)，男，浙江瑞安人，副主任医师，从事心血管内科。

蒋金法（1958—），主任医师；电子信箱：jiangjinfa83 @163.com