吐鲁番黑羊MC1R基因序列分析研究

於建国，陈 童，刘明军

（1.新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐830000；2.新疆畜牧科学院绵羊研究中心，乌鲁木齐830000）

吐鲁番黑羊MC1R基因序列分析研究

於建国1，陈 童1，刘明军2

（1.新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐830000；2.新疆畜牧科学院绵羊研究中心，乌鲁木齐830000）

为研究黑皮质素受体1（MC1R）基因对吐鲁番黑山羊毛色的影响，试验采用PCR扩增和测序技术，对吐鲁番黑羊MC1R基因编码区核苷酸序列及其与毛色的相关性进行了研究。结果表明：MC1R基因编码区核苷酸序列954 bp，编码317个氨基酸，编码区存在2个错义突变（c.218 T>A，p.73 Met>Lys；c.361 G>A，p.121 Asp>Asn）和3个同义突变（c.429 C>T，p.143 Tyr>Tyr；c.600 T>G，p.200 Leu>Leu；c.735 C>T,p.245 Ile>Ile）。SNPs分析表明,单倍型AATGT数量占62%。初步认为MC1R基因可以作为吐鲁番黑羊黑色被毛调控的候选基因。

吐鲁番黑羊；MC1R；SNPs；候选基因

吐鲁番黑羊也称托克逊大尾黑羊，是由当地农牧民通过引进巴音布鲁克羊与哈萨克羊、卡拉库尔羊进行杂交，长期选育而培育出的肉用型地方品种。托克逊县为其主产区，目前存栏20余万只，占吐鲁番黑羊的90%。周岁种公羊体重44.06kg，成年种公羊体重46.38kg，周岁羊与成年公羊体重相差小。吐鲁番黑羊背腰平直，十字部高于耆甲部，头稍长，鼻梁微隆起，耳下垂，少数有不发达的角。四肢粗壮，尾肥大，被毛黑色。具有生长迅速、四肢粗壮、早熟、肉味鲜美等特点。其遗传特征基本稳定，深受当地群众的喜爱［1］。

哺乳动物的毛色类型很多，已有的研究结果表明，真黑色素和褐黑色素两种基本黑色素的合成受E（extension）和A（agouti）基因座位控制。E座位编码的黑素皮质素受体1（MC1R）是G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor）家族中最小的受体，只有一个编码区，其编码的蛋白质有7个跨膜结构域，主要表达于动物的黑色素细胞。它与a-促黑色素细胞激素（a-MSH）作用，对酪氨酸酶进行调控，进而调控黑色素的形成。黑素皮质素受体1（melanocortin 1 receptor，MC1R）基因研究起步较早，但在绵羊上开展的研究相对较少，国内在绵羊毛色方面开展MC1R基因的相关研究报道也不多［2-7］。本研究以吐鲁番黑羊为研究对象，分析黑素皮质素受体1基因与吐鲁番黑羊毛色性状的相关性，为更好地开发利用吐鲁番黑羊这一特殊的毛色绵羊遗传资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集及DNA的提取

在托克逊县吐鲁番黑羊原产地用真空采血管采集纯种吐鲁番黑羊血液样品60份，每个样品采集2 mL，肝素钠抗凝，低温带回实验室-20℃保存。采用全血DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

1.2 PCR扩增

MC1R基因扩增引物根据GenBank中收录的绵羊序列Y13965，用Primer 5.0软件进行引物设计。引物序列为F：GAGAGCAAGCACCCTTTCCT，R：GAGAGTCCTGTGATTCCCCT，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应总体积25μL，其中：Buffer3μL，dDNTP2μL，上下游引物各1 μL，Taq酶1 U，DNA模板1 μL，灭菌去离子水补足到25 μL。PCR反应扩增条件：94℃，3 min；94℃30 s，62℃30 s，72℃45 s（35个循环），72℃10 min，4℃保存。采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，选择目的条带清晰的PCR样品送博迈德生物公司进行测序。应用Chromas、Dnaman等软件进行序列拼接、同源性分析以及进化树的建立。

2 结果与分析

2.1 MC1R基因序列PCR扩增结果

对吐鲁番黑羊MC1R基因进行PCR扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明MC1R基因扩增产物在1000bp近上方有一条特异性条带，与预期结果相同。见图1。

图1 MClR基因序列PCR产物电泳结果

2.2 MC1R基因核苷酸序列

吐鲁番黑羊MC1R基因PCR扩增产物经测序获得1 124 bp核苷酸序列，开放阅读框（ORF）长954 bp，编码317个氨基酸。在编码区存在2个错义突变（c.218 T>A，p.73 Met>Lys；c.361 G>A，p.121 Asp>Asn)和3个同义突变（c.429 C>T，p.143 Tyr>Tyr；c.600 T>G，p.200 Leu>Leu；c.735 C>T，p.245 Ile>Ile）。见图2。

图2 吐鲁番黑羊MClR基因单碱基突变位点

2.3 吐鲁番黑羊MC1R基因SNPs

测序结果显示，吐鲁番黑羊毛色基因MC1R在编码区核苷酸存在218 T>A，361 G>A,429 C>T，600 T>G，735 C>T颠换与转换。由表1可知，吐鲁番黑羊MC1R基因存在3种单倍型，其中TGCTC型有5只，占8%；TGTGT型有18只，占30%；AATGT型有37只，占62%。

表1 吐鲁番黑羊MClR基因单倍型频率

3 讨论

哺乳动物的MC1R基因与皮肤色素沉积、被毛颜色密切相关，该基因主要在毛囊和皮肤黑素细胞中表达，MC1R基因通过控制真黑色素数量来决定动物的毛色。当MC1R受到ɑ-促黑色素细胞激素（a-MSH）的刺激时就会通过激活酪氨酸酶产生真黑色素,使动物毛色表现为黑色。在MC1R功能丧失或MC1R受到与其拮抗的Agouti蛋白抑制时，酪氨酸酶不能被激活而保持较低活性，造成真黑色素被稀释，出现棕色或红色等较浅的毛色性状。绵羊的MC1R基因位于14号染色体，有单一外

显子基因，相比ASIP等其他毛色基因研究的较多。MC1R基因主要有3个等位基因（E+、ED和e）在编码区发生碱基突变导致被毛颜色发生变化。本研究发现，218 bp（T>A）和361 bp（G>A）两处碱基突变导致M73K和D121N氨基酸变化，这两处突变在黑色美利奴羊、卡拉库尔羊等绵羊品种中也有发现，M73K和D121N单独或共同作用于绵羊黑色被毛性状，即等位基因ED引起绵羊被毛出现黑色性状。李洪涛等［8］的研究发现，MC1R基因P.M73K位点变化与哈萨克羊被毛的颜色变化相关，MC1R基因是控制哈萨克绵羊被毛颜色的主效基因。

本研究结果显示：MC1R基因在编码区核苷酸存在218 T>A，361 G>A，429 C>T，600 T>G，735 C>T颠换与转换，其中218 bp（T>A）和361 bp（G>A）2处发生颠换、转换数量最多，AATGT单倍型比例占62%。由218bp（T>A）和361 bp（G>A）2处位点突变引起氨基酸73（Met>Lys）和121（Asp>Asn）发生错义突变，此结果与李洪涛等［8］研究绵羊毛色基因MC1R在黑色被毛基因调控的机理相吻合。MC1R基因核苷酸序列中单倍型TGCTC、TGTGT、AATGT分别占8%、30%、62%，与Guang-LiYang等［2］在研究岷县黑羊的研究结果相一致。

4 结论

MC1R基因编码区核苷酸序列长954 bp，编码317个氨基酸，编码区存在2个错义突变（c.218 T>A，p.73 Met>Lys.c.361 G>A，p.121 Asp>Asn)和3个同义突变（c. 429 C>T，p.143 Tyr>Tyr；c.600 T>G，p.200 Leu>Leu.c.735 C>T，p.245 Ile>Ile）。SNPs分析显示，单倍型AATGT数量占62%。初步认为MC1R基因可以作为吐鲁番黑羊黑色被毛调控的候选基因。

［1］阿斯娅·买买提,买买提伊明·巴拉提孙,努尔比亚木·萨吾提,等.吐鲁番黑羊种公羊体质量、体尺参数的研究［J］.河南农业科学，2013，42（1）：125-128.

［2］Guang-Li Yang，Dong-Li Fu，Xia Lang，et a1.Mutations in MC1R gene determine black coat color phenotype in Chinese Sheep［J］.The Scientific World Journal，2013（1）：675382-675389.

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［4］李鹏飞，董常生，杜海燕，等.黑色素皮质素受体1（MC1R）基因与哺乳动物毛色［J］.畜牧兽医杂志，2006，25（1）:21-22.

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［6］于云柱，何奕多，刘丽，等.黑素皮质素受体1（MC1R）基因的研究进展［J］.中国畜牧兽医2010，37（6）：232-233.

［7］唐懿挺，钟红梅，姬秋梅，等.牦牛MC1R基因的克隆测序及其分析研究［J］.生物技术通报，2011，6:88-93.

［8］李洪涛，曾献存，张文祥，等.哈萨克绵羊MC1R和ASIP基因多态性及表达量与被毛颜色表型相关性的研究［J］.畜牧兽医学报，2013，44（3）：366-375.

Analysis on MC1R Sequences of Turpan Black Sheep

Yu Jian-guo1，Chen Tong1，Liu Ming-jun2
（1.XinjiangAcademyofAnimal Sciences，Urumqi 830000，China；2.XinjiangAcademyofBiotechnological Center，Urumqi 830000，China）

Tostudythe effects ofmelanocortin receptor 1（MC1R）on the wool colour in Turpan black sheep，the codingregion nucleotide sequence ofMC1R gene ofTurpan black sheep and its correlation with the wool colour were studied byusingPCR amplification and sequencingtechniques.The results showed that the codingregion nucleotide sequence ofMC1R gene was 954 bp,encoding 317 amino acids,there were two missense mutations（c.218 T>A，p.73 Met>Lys；c.361 G>A，p.121 Asp>Asn）and three silent mutations（c.429 C>T，p.143 Tyr>Tyr；c.600 T>G，p.200 Leu>Leu；c.735 C>T，p.245 Ile>Ile）in the coding region.SNPs haplotype of AATGT accounted for 62%.It is suggested that the MC1R gene can be used as the candidate gene in regulating the black wool ofTurpan black sheep.

Turpan black sheep；MC1R；SNPs；candidate gene

S826.2

A

2095-3887（2014）04-0016-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.04.004

2014-04-26

新疆自治区科研院所基本科研业务费

於建国（1977-），男，助理研究员，硕士。

刘明军（1964-），男，研究员，博士。研究方向：分子生物学。