藏系绵羊MSX2和HOXA4基因的克隆与序列分析

付 伟，任 亮，王 永，李彩霞，黄 林，林亚秋，郑玉才

（1．西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041；2.西南民族大学青藏高原研究院）

藏系绵羊MSX2和HOXA4基因的克隆与序列分析

付 伟1，任 亮1，王 永2，李彩霞1，黄 林1，林亚秋1，郑玉才1

（1．西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041；2.西南民族大学青藏高原研究院）

对藏系绵羊的同源异型基因家族的两个成员（MSX2和HOXA4基因）进行克隆测序，为其功能分析奠定基础。从藏系绵羊皮肤中提取总RNA，采用常规的基因克隆方法，获得了MSX2和HOXA4基因编码区序列，长度分别为804 bp和552 bp。序列比对显示，MSX2基因与预测的绵羊序列存在多个碱基差异；藏系绵羊HOXA4基因与预测的山羊序列间只有1个碱基差异，但与绵羊的预测序列差异大。

藏系绵羊；MSX2基因；HOXA4基因；毛囊

藏系绵羊是我国独特的绵羊品种之一，主要分布在高海拔的川、藏、滇等地。由于生长环境和地域的差异，藏系绵羊又可分为高原型、山谷型和山地型［1］。高原型藏系绵羊主要是生活在青藏高原地区的藏系绵羊，体型健硕，被毛异质，主要由两型毛构成，具有毛辫长、弹性强、光泽好等特点，在国内外市场尤以“西宁毛”著称，是编织优质地毯的原料［2］。

同源异型基因（homeobox gene，HOX）家族包括多个成员，均含有一个高度保守的同源异型盒，用于编码转录调控因子，在细胞的增殖分化中发挥重要调节作用。Noveen等［3］研究表明，同源异型基因家族中的MSX2基因和MSX1基因协同作用，影响皮肤的生长发育；另外的研究则发现，MSX2基因可促进动物皮肤、毛囊等的分化和形成，参与毛囊发生中的信号传导，对动物毛发的正常生长发育至关重要［4-6］。HOXA4基因是HOX基因家族的另外一个成员，目前对该基因的研究相对较少。有报道HOXA4基因在动物胚胎期和胎儿的皮肤中表达［7-8］。GenBank中已有绵羊MSX2、HOXA4基因的预测序列，但尚未得到实际的实验验证。本研究对成年藏系绵羊皮肤中的MSX2基因和HOXA4基因进行克隆测序，旨在比较其与普通绵羊、山羊的序列差异，为进一步研究其功能提供资料。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

以生活在四川省阿坝州的成年高原型藏系绵羊为试验动物，于冬季采集刚刚屠杀的母藏系绵羊腹部的皮肤样品，去掉皮肤表皮层，用生理盐水冲洗后立即置于液氮中冻存。

1.2 主要试剂和仪器

Trizol Reagent（Ambion公司，美国），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific公司，美国），Cycle-pure Kit（OMEGA公司，美国），pMD 19-T Vector购自日本TaKaRa公司，Super Taq DNA Polymerase购自美国GeneCopoeia公司，DL2000 marker、DH5α感受态细胞等均购自天根生化科技（北京）有限公司。

C1000 Thermal Cycler梯度PCR仪、Versa Doc 1000凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司产品；Biowave紫外可见分光光度计为英国Biochrom公司产品；CR21G高速冷冻离心机为日本日立公司产品。

1.3 总RNA的提取及反转录

按照RNA试剂盒说明书方法，Trizol法提取藏系绵羊皮肤的总RNA，紫外分光光度法测定核酸浓度。利用RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit以4μg总RNA为模板，利用随机引物进行反转录，两步反应得到了cDNA第一链。

1.4 目的基因PCR扩增

根据 GenBank中绵羊 MSX2基因预测序列（XM_004017109） 和山羊 HOXA4基因预测序列（XM_005679274.1），用Primer 5.0软件设计2对引物，分别是MSX2-F：GTCATGGCTTCTCCGTCCAAAG，MSX2-R：CGGAGTCTATTGAGCTGGTCT TCC，扩增长度837 bp；HOXA4-F：CGAGACGACAAACTGTTAGGGC，HOXA4-R：AGGTGAGGGACAGAACTGGTCTAG，扩增长度709bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

以反转录得到的藏系绵羊皮肤cDNA为模板，进行目的基因的PCR扩增，反应体系为25 μL，包括10×Reaction Buffer 2.5 μL，10 mM dNTP 0.5 μL，Super Taq DNA Polymerase 0.2 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL，加灭菌ddH2O至25 μL。PCR程序：95℃3 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃90 s，35个循环，72℃5 min，4℃保存。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。参照Cycle-pure Kit说明书的具体步骤纯化上述PCR产物。

1.5 阳性克隆筛选及测序

按照常规的分子生物学方法，将纯化的RT-PCR产物与pMD 19-T Vector进行连接，然后将连接产物转化DH5α感受态细胞，培养后通过PCR扩增鉴定阳性克隆。每个基因选取5个阳性克隆菌液送上海生工生物工程有限公司进行双向测序。用DNAMAN4.0软件分析测序结果。

2 结果与分析

2.1 藏系绵羊MSX2、HOXA4基因的克隆测序

利用设计的MSX2和HOXA4基因的PCR引物，以藏系绵羊皮肤中提取的总RNA为模板，均扩增出了特异的产物，长度与预期结果相符。PCR产物经连接、转化等步骤，获得了相应基因的阳性克隆，经测序证实分别为MSX2、HOXA4基因，长度分别为831 bp和709 bp。

图1 藏系绵羊MSX2、HOXA4基因的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图

2.2 藏系绵羊MSX2基因序列分析

藏系绵羊MSX2基因编码区为804 bp，与普通绵羊预测序列（XM_004017109）长度不同，它们的匹配序列（804 bp）相比存在6个碱基差异（图2），相似性为99.25%。值得注意的是，藏系绵羊MSX2基因序列中缺失了6个碱基（435～440）。藏系绵羊MSX2基因编码区与山羊（NM_001285601.1）长度相同，但有31个碱基不同，相似性为96.14%（图未显示）。

藏系绵羊MSX2基因推导的氨基酸序列包含267个氨基酸，理论分子量为28.976 kD，预测的理论等电点为10.32；与普通绵羊 MSX2基因的氨基酸序列（XP_004017158.1）相比，等电点不变，但存在3个氨基酸差异，并缺失了连续的2个氨基酸，相似性为98.88%（不包括缺失氨基酸，表1），差异和缺失的氨基酸均为中性氨基酸，因而不影响该蛋白的总体电荷特征。与山羊MSX2基因推导的氨基酸序列（NM_001285601.1或NP_001272530.1）相比，存在18个氨基酸差异，相似性为93.18%。普通绵羊预测序列（XM_004017109）比藏系绵羊MSX2基因推导的氨基酸序列多出77个氨基酸。

表1 藏系绵羊和普通绵羊MSX2基因推导的氨基酸序列对比

2.3 藏系绵羊HOXA4基因序列分析

藏系绵羊HOXA4基因的CDS区为552 bp，与绵羊预测序列（XP_004008301.1,长度657 bp）相比差异很大（图3），但与山羊预测序列（XM_005679274.1）相比仅第146位的碱基存在差异（藏系绵羊为T，山羊为C），相似性为99.82%。该突变导致了氨基酸差异，藏系绵羊为脯氨酸，而山羊为亮氨酸，氨基酸性质差异不大。

藏系绵羊HOXA4基因推导的氨基酸序列编码183个氨基酸，理论分子量为20.77 kD，预测等电为10.49。山羊HOXA4基因也编码183个氨基酸（XM_005679274. 1），预测的理论等电点与藏系绵羊相同，二者仅有1个氨基酸差异，相似性为99.46%。预测的绵羊HOXA4蛋白（XP_004008301.1）则包含218个氨基酸，与藏系绵羊预测序列相比，C-末端115个氨基酸序列完全相同，而前面的氨基酸序列无法匹配。

图2 藏系绵羊与普通绵羊MSX2基因序列比对

图3 藏系绵羊与普通绵羊HOXA4基因序列比对

3 讨论

本研究成功地克隆了藏系绵羊的MSX2和HOXA4基因，其序列与普通绵羊的预测序列相比，均存在不同程度的差异，可能与绵羊的品种或预测有误有关。藏系绵羊MSX2基因编码区序列与普通绵羊预测序列（XM_004017109） 长 度 不 同 ， 但 与 山 羊 序 列（NM_001285601.1）相同。三者匹配序列（804 bp）相似性较高，尤其是与普通绵羊预测序列。因此，推测普通绵羊MSX2基因预测序列在N-末端有误。类似的问题也存在于HOXA4基因中，即预测的绵羊HOXA4蛋白（XP_004008301.1）的C-末端115个氨基酸序列与藏系绵羊完全相同，而前面的氨基酸序列无法匹配。

藏系绵羊生活在高寒、低氧的特殊生态环境中［2］，其绒毛特性对适应特殊生态环境可能有重要作用。因此，分析与藏系绵羊毛囊发育相关的基因，对阐明畜禽与环境的互作、重要经济性状的功能基因等具有十分重要的意义。本研究结果为进一步分析MSX2和HOXA4基因的功能奠定了必要的基础。

［1］徐琳娜，李国林.藏系绵羊遗传多样性的研究进展［J］.畜牧兽医杂志，2012，31（4）：56-60.

［2］王光明.海西州高原型藏羊种质资源调查［J］.畜牧与兽医，2012，44（4）：51-53.

［3］Noveen A，JiangTX，Ting-Berreth SA，et al.Homeoboxgenes Msx-1 and Msx-2 are associated with induction and growth of skin appendages［J］.J Invest Dermatol，1995，104（5）：711-719.

［4］Ma L，Liu J，Wu T，et al.'Cyclic alopecia'in Msx2 mutants：defects in hair cycling and hair shaft differentiation［J］.Development，2003，130（2）：379-389.

［5］Cai J，Lee J，Kopan R，et al.Genetic interplays between Msx2 and Foxn1 are required for Notch1 expression and hair shaft differentiation［J］.Dev Biol，2009，326（2）：420-430.

［6］Kim B K，Yoon S K.Hairless down-regulates expression of Msx2 and its related target genes in hair follicles［J］.J Dermatol Sci，2013，71（3）：203-209.

［7］Stelnicki E J，Kömüves L G，Kwong A O，et al.HOX homeobox genes exhibit spatial and temporal changes in expression during human skin development［J］.J Invest Dermatol，1998，110（2）：110-115.

［8］Packer A I，Jane-Wit D，McLean L，et al.Hoxa4 expression in developing mouse hair follicles and skin［J］.Mech Dev，2000，99（1-2）：153-157.

Cloning and Sequence Analysis of MSX2 and HOXA4 Genes of Tibetan Sheep

Fu Wei，Ren Liang，ZhengYu-cai，et al
（College ofLife Science and Technology，Southwest Universityfor Nationalities，Chengdu 610041，China）

The objective ofthis studywas toclone and sequence the twomembers ofthe homeoboxgene family（MSX2 and HOXA4 gene ofTibetan sheep）and provide data for their function validation.Total RNA was extracted from the skin of Tibetan sheep and the cDNA encoding MSX2 and HOXA4 was obtained by the reverse transcription PCR（RT-PCR）.The coding region of MSX2 and HOXA4 gene were 804 bp and 551 bp，respectively.Sequence alignment revealed several nucleotides difference between Tibetan sheep MSX2 gene and predicted sequence of sheep MSX2 gene；only one nucleotide difference existed between HOXA4 gene of Tibetan sheep and the predicted sequence of goat HOXA4，but Tibetan sheep HOXA4 gene showed great differences when compared with the predicted HOXA4 sequence ofsheep.

Tibetan sheep；MSX2 gene；HOXA4 gene；hair follicle

S826.8+3

A

2095-3887（2014）04-0009-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.04.002

2014-04-14

国家863项目（2013AA102506）

付伟（1989-），男，硕士研究生。

郑玉才，Email:yucaizheng65@hotmail.com