四角蛤蜊醇沉上清液对CCl4致小鼠急性肝损伤保护作用

2014-03-01陆杰霖刘秋风贾梦蛟王欣之南京中医药大学江苏省海洋药用生物资源研究与开发重点实验室江苏南京210023

食品工业科技 2014年14期

陆杰霖，刘秋风，贾梦蛟，柴　尧，刘　睿，王欣之，吴　皓（南京中医药大学江苏省海洋药用生物资源研究与开发重点实验室，江苏南京210023）

陆杰霖，刘秋风，贾梦蛟，柴尧，刘睿，王欣之，吴皓*
（南京中医药大学江苏省海洋药用生物资源研究与开发重点实验室，江苏南京210023）

目的：研究四角蛤蜊醇沉上清液对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用。方法：四氯化碳造成急性肝损伤模型，测定小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST），还原性谷胱甘肽（GSH）活性；测定肝匀浆中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力，对肝组织进行病理学检查。结果：醇沉上清液（MS）高、中、低剂量组具有明显的剂量依赖性降低CCl4致小鼠肝损伤血清ALT，AST，GSH（p＜0.01），高、中剂量组降低肝匀浆中MDA的含量（p＜0.05），增强SOD的活性（p＜0.01）。通过病理学切片观察，MS各剂量组能显著改善肝组织的病理变化。结论：MS对CCl4造成的小鼠急性肝损伤具有显著的保护作用。

四角蛤蜊醇沉上清液，四氧化碳，保肝作用

四角蛤蜊（Mactra venerformis）为软体动物门（Mollusca），隶属于瓣鳃纲（Lamellibranchia）异齿亚纲（Helterodonta）帘蛤目（Veneroida）蛤蜊科（Mactride）的动物，是一种分布于我国南北各海区较大型的经济贝类[1]。现代研究表明，四角蛤蜊具有较好的抗氧化活性，其活性较强部位在四角蛤蜊的水提醇沉上清液中[2]。课题组前期研究表明，四角蛤蜊醇沉上清液经分析测定，含有核苷类[3]占上清液中总量为2%左右、总氨基酸占上清液中30%左右，上清液中还含有脂肪酸类及甾醇类等小分子。本文以腹腔注射四氯化碳的方法建立小鼠急性肝损伤模型，评价四角蛤蜊水提醇沉上清液的保肝活性。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

四角蛤蜊江苏省海洋水产研究所提供，批号：20100706，经江苏省海洋水产研究所万夕和研究员鉴定为蛤蜊科动物四角蛤蜊（Mactra veneriformisReeve）的新鲜软体部分；ICR小鼠18～22g，雄性，清洁级，南京医科大学实验动物中心提供，动物生成许可证SCXK（苏）2008-0004；联苯双脂北京协和药厂，产品批号：12060105；四氯化碳成都市科龙化工试剂厂，批号：20120220，使用时用花生油配制成0.1%的花生油溶液，现配先用；氯化钠注射液南京小营药业集团有限公司，批号：12012110606；BCA蛋白测试盒、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）试剂盒均为南京建成生物工程研究所提供。

YP6002型电子天平上海光正医疗仪器有限公司；3-16PK型台式高速冷冻离心机Sigma；XHF-P型高速分散器内切式匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司；80-2B型台式离心机上海安亭科学仪器厂制造；RT-6000型酶标仪美国雷杜；HH-4数显恒温水浴锅国华电器有限公司；Waters 2695液相色谱仪美国Waters公司；BP211D型电子分析天平德国Satrorius公司；KQ-250型超声清洗器昆山超声仪器有限公司；纯水机美国Millipore公司；FA1104型电子分析天平上海精密科学仪器有限公司。

1.2样品制备

取新鲜四角蛤蜊软体15kg，洗净泥沙，沥干后绞碎，放入多功能提取罐，加3倍量水，每次煮沸40min，煎煮3次，除去滤渣，合并滤液，得到四角蛤蜊总提液。将滤液浓缩至适量，14000r/min离心，取上清液，加入95%乙醇，使乙醇质量分数达到65%，搅匀，静置24h，抽滤，得沉淀和上清液。将沉淀用适量水复溶后加95%乙醇，使乙醇质量分数达75%，搅匀，静置24h，合并两次上清，加压回收乙醇，得褐色的上清液浸膏，即得四角蛤蜊醇沉上清液（MS）。

1.3动物实验

1.3.1动物分组和造模方法取60只小鼠，随机分成6组，每组10只，分别为正常对照组，四氯化碳模型组，MS的低、中、高剂量组（250、500、1000mg/kg）及联苯双酯组（150mg/kg）。正常对照组和CCl4模型组给予等量的生理盐水，给药组连续灌胃7d，于末次给药1h后，除正常组对照腹腔注射花生油20mL/kg外，其余各组均腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液20mL/kg。禁食（不禁水）16h后，所有小鼠眼眶放血取血后，分离血清，测定血清中ALT、AST及GSH的活性。取血后小鼠立即解剖，取一小块肝组织，均取相同部位，用4%左右的福尔马林溶液固定，进行石蜡包埋切片。同时另取相同部位的一块肝组织用生理盐水制备成10%的肝匀浆，低温离心后去上清液，用硫代巴比妥酸法测定肝匀浆上清液中MDA含量，用黄嘌呤氧化酶法测定匀浆上清液中SOD活力。

1.3.2生化指标检测赖氏法测定血清中ALT，AST活性，二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）法测定GSH，硫代巴比妥酸法测定肝匀浆上清液中MDA含量，二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法测定肝匀浆上清液中的蛋白含量，黄嘌呤氧化酶法测定匀浆上清液中SOD活力。

1.3.3病理学检查用4%左右的福尔马林溶液固定肝组织，常规石蜡包埋切片（片厚4μm），进行HE染色，光学显微镜下观察肝组织病理学变化，检查下列指标：a.有无肝细胞脂变、水肿；b.有无肝细胞坏死；c.肝小叶内有无炎细胞浸润；d.门管区有无炎症及纤维组织增生。

1.4数据处理

2　结果与分析

2.1MS对急性肝损伤小鼠血清生化指标的影响

CCl4模型组血清中ALT、AST、GSH的含量与正常对照组相比，均明显升高（p＜0.01），见表1，说明本次实验动物模型造模成功。MS的低、中、高剂量组及阳性药对照组组血清ALT、AST、GSH活性与模型组相比具有显著性差异（p＜0.01），给药组呈剂量依赖性。其中，高剂量组其保肝活性与阳性对照药联苯双酯接近。

本实验结果显示，CCl4诱导小鼠肝细胞损伤，从形态学及血清中ALT、AST活性测定显示，损伤组与空白对照组相比明显升高，而经过预期给药四角蛤蜊醇沉上清液7d的给药组血清中ALT、AST明显下降（p＜0.01），且呈一定的剂量依赖性，证实四角蛤蜊醇沉上清液能减轻CCl4所致急性肝损伤。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的天然小分子三肽，作为体内的中药保护因子，对保护生物膜及生物大分子免受自由基损伤起着极其重要的作用[4]，保护损伤的细胞。本实验中，模型损伤组GSH显著的升高，而预防性给予四角蛤蜊醇沉上清液的给药组，GSH均显著性的降低，且如同ALT、AST一样，呈剂量依赖性。

2.2MS对急性肝损伤小鼠肝匀浆上清液中MDA含量、SOD活性的影响

CCl4模型组小鼠肝匀浆上清液MDA含量显著升高（p＜0.01），SOD活性显著降低（p＜0.01），MS对MDA有较强的抑制作用，能提高SOD的活性。其中，MS的中、高剂量组与联苯双脂组肝匀浆上清液中的MDA含量及SOD活性与模型组比较具有显著性差异（p＜0.05）。自由基是启动脂质过氧化的关键性的因素，当自由基含量越高时，说明肝脏的损伤程度也是越严重的，SOD是超氧阴离子自由基的清除剂，可以抑制自由基启动的脂质过氧化；MDA会导致细胞膜结构、功能和代谢发生改变，能使膜通透性增加，对机体造成损伤[5]。本实验表明，MS中、高剂量组可以显著降低CCl4致急性肝损伤小鼠肝匀浆上清液中MDA含量的升高（p＜0.05），提高SOD的活性（p＜0.01），提示了四角蛤蜊醇沉上清液对肝脏的保护作用也许是通过抗自由基及抑制脂质过氧化而发挥作用的。

表1　MS对急性肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响（±s，n=8）Table 1　Effect of MS on ALT,AST by liver damaged（±s，n=8）

注：与模型组相比，*：p<0.05，**：p<0.01；表2同。

组别　剂量（mg·kg-1）　ALT（U·L-1）　AST（U·L-1）　GSH（μmol·gprot-1）正常对照　－　34.87±10.38**　28.76±5.84**　67.83±22.81**模型组　－　151.72±20.35　59.10±4.44　98.48±18.36联苯双脂组　150　51.61±23.50**　27.60±3.96**　67.17±8.41**MS组250　85.36±29.97**　32.91±4.07**　69.35±11.25**500　71.54±26.58**　28.58±4,47**　64.78±14.81**1000　54.79±22.67**　27.10±3.52**　61.96±11.08**

表2　MS对急性肝损伤小鼠肝匀浆MDA，SOD的影响（±s，n=8）Table 2　Effect of MS on MDA,SOD and liver index by liver damaged（±s，n=8）

SOD（U·mg prot-1）正常对照　－　2.79±0.58**　29.67±2.50**模型组　－　4.17±1.16　26.24±2.61联苯双脂组　150　2.91±0.60*　29.91±2.58*组别　剂量（mg·kg-1）MDA（nmol·mg prot-1）MS组250　3.90±1.05　41.72±2.87**500　2.83±0.59*　44.37±3.40**1000　2.69±0.60*　52.00±3.70**

2.3MS对急性肝损伤小鼠肝组织病理学的影响

病理切片结果表明，正常对照组小鼠肝脏肝小叶略呈六边形，结构清晰，肝细胞无变形、坏死，门管区无炎症或纤维组织增生，小叶间动脉、小叶间静脉和小叶间胆管无病变。本组每例小鼠的肝脏各个部位均未见明显病变。CCl4模型组小鼠主要为气球样变，变形的肝细胞体积明显增大，胞浆疏松、淡染，核结构欠清，集聚成灶状分布，气球样变的肝细胞灶内或周围少数肝细胞嗜酸性坏死，肝小叶和门管区见中度炎细胞浸润。MS低剂量组病变程度明显轻于模型组，与高剂量、中剂量组比较，病变略明显，肝细胞未见明显水肿、脂变或气球样变，4例小鼠有轻微或轻度嗜酸变性，变性的肝细胞表现为细胞体积缩小，胞浆深伊红染，细胞核变小；中剂量组肝细胞病变程度明显轻于模型组，病变程度较高剂量组略明显，肝细胞有轻微水肿及轻微炎细胞浸润；高剂量组肝细胞病变明显轻于模型组，未见明显变性，表明MS高剂量组在保护肝损伤作用方面最佳，见图1。

3　结论

通过现代药理研究手段初步证实了四角蛤蜊水提醇沉上清液具有保肝活性，符合了传统中医理论关于蛤蜊能解酒毒和润五脏的认识。本文研究可以初步判定核苷、氨基酸类是四角蛤蜊起保肝活性的物质成分，为四角蛤蜊新药或功能性产品的研发奠定了理论基础。

Experimental study on ethanol subsiding method from Mactra veneriformis on acute hepatic injury induced by carbon tetrachloride in mice

LU Jie-lin，LIU Qiu-feng，JIA Meng-jiao，CHAI Yao，LIU Rui，WANG Xin-zhi，WU Hao*
（Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu Key Laboratory of Research and Development in Marine Bio-resource Pharmaceutics，Nanjing 210023，China）

Objective：The effect of ethanol subsiding method from Mactra veneriformis（MS）was studied by carbon tetrachloride（CCl4）-induced liver injury in mice.Methods：Blood tissue samples were collection.Evaluations were made for lipid peroxidation，enzyme activities and biochemical parameters.Pathological histology was also performed.Results：MS pretreatment reduced the serum aspartate aminotransferase（ALT），alanine aminotransferase（AST），andreducedglutathioneactivities.Bycontrast，MSpretreatmentreduced liver MDA content and increased liver tissue SOD.The CCl4-induced histopathological changes were also reduced by the MS pretreatment.Conclusion：MS could be proposed to protect the liver damage induced by CCl4.

ethanol subsiding method from Mactra veneriformis；CCl4；hepatoproteaction