滇重楼多糖不同提取方法的比较研究

周 浓，郭冬琴，汪开拓，张德全，蓬国辉，张春芹（.重庆三峡学院生命科学与工程学院，重庆万州404000；.大理学院药学院，云南大理67000）

滇重楼多糖不同提取方法的比较研究

周 浓1，2，郭冬琴1，汪开拓1，张德全2，*，蓬国辉1，张春芹2
（1.重庆三峡学院生命科学与工程学院，重庆万州404000；2.大理学院药学院，云南大理671000）

对滇重楼多糖的不同提取工艺进行研究。探讨料液比、提取时间、提取温度和提取次数对多糖得率的影响，在单因素实验的基础上，通过正交实验确定最佳提取工艺条件。结果表明：回流提取的最佳工艺条件为在95℃水浴条件下，以1∶60（g∶mL）的料液比，提取时间1h，提取3次，最优工艺条件下多糖提取率可达18.72mg/g；热水浸提的最佳工艺条件为在85℃水浴条件下，以1∶80（g∶mL）的料液比，提取1.5h，提取2次，最优工艺条件下多糖提取率可达23.84mg/g；超声波辅助提取的最佳工艺条件为在50℃水温条件下，以1∶50（g∶mL）的料液比，提取1.5h，提取2次，最优工艺条件下多糖提取率可达24.32mg/g。3种提取方法对滇重楼多糖提取率影响差异不显著，但超声波辅助提取较热水浸提、回流提取具有能耗低的优点。

滇重楼，多糖，正交实验，回流提取法，热水浸提法，超声波辅助提取法

滇重楼（Paris polyphylla Smith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.）为百合科重楼属植物，被《中国药典》收载为中药材重楼的基原植物之一，其根茎中主要含甾体皂苷、黄酮类和多糖类活性成分，具有抗肿瘤、止血、镇痛、免疫调节等生物活性[1-2]。研究表明植物多糖具有抗肿瘤、抗衰老、调节免疫功能、保护心血管、降血压、降血脂等作用，已有猪苓多糖、香菇多糖、灵芝多糖等应用于临床[3-5]。前期研究表明滇重楼多糖具有显著的免疫增强作用，并测定了其含量[6]，对其提取工艺的研究尚未见报道。本实验参照文献[7-9]，采用热水回流提取法、热水浸提法、超声提取法提取滇重楼中多糖，以多糖的提取率为考察指标，获得最佳的提取工艺条件，为滇重楼多糖在食品、医药等行业的应用提供依据和思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

D-无水葡萄糖对照品 中国食品药品检定研究院，批号：110833-201205，供含量测定用；蒽酮、浓硫酸、无水乙醇、三氯甲烷、石油醚（60～90℃）、正丁醇 分析纯；滇重楼样品 2012年10月采集于云南省大理市花甸坝药材场，并经作者本人鉴定为百合科植物滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis的干燥根茎；水 蒸馏水。

UV-2450型紫外可见分光光度计 日本岛津公司；CP225D型分析天平 德国Sartorius公司；SB-5200DTN型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；RV10 basic V型旋转蒸发仪 德国IKA集团；TDZ5-WS型多管架自动平衡离心机 湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；DC-100型多功能粉碎机（功率700W，28000r/min） 浙江武义鼎藏日用金属制品厂。

1.2 实验方法

1.2.1 滇重楼多糖提取工艺流程 滇重楼洗净→烘干→粉碎（80目）→石油醚回流脱脂[8]→过滤→滤渣按一定比例加入蒸馏水→不同方法提取→过滤→减压浓缩→80%乙醇醇沉过夜（静置24h）[8]→离心（4000r/min，15min）、过滤→Savage法除蛋白[10]→80%乙醇醇沉过夜（静置24h）[8]→过滤、沉淀加蒸馏水定容至50mL→UV检测→计算提取率。

1.2.2 标准曲线的制备 取葡萄糖对照品适量，精密称定，加双蒸水制成每1mL含100μg的溶液，即得对照品贮备液。精密量取葡萄糖对照品贮备液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0mL，分别置于10mL具塞刻度试管中，各加蒸馏水补至2.0mL，置于冰水中再精密加蒽酮溶液6.0mL，摇匀，于100℃沸水浴显色15min，冷却至室温后，定容至刻度，流水冷却至室温，以2.0mL蒸馏水按同样显色条件作为空白，在625nm的波长处测定吸光度（A）[11]。以葡萄糖检测浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A=0.0259，C-0.0051，r=0.9998。结果表明，葡萄糖对照品在5.05～25.25μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

1.2.3 滇重楼多糖含量测定 精密量取供试品溶液0.5～2.0mL，置10mL具塞刻度试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“各加蒸馏水补至2.0mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中多糖的浓度，计算公式如下[12]：多糖的提取率（%）=多糖的浓度（g/mL）×溶液体积（mL）×稀释倍数/原料质量（g）×10-6×100，即得。

1.2.4 正交实验 在单因素实验基础上，以料液比、时间、温度、提取次数为考察因素，设计L（934）正交实验来确定回流提取法（表1）、热水浸提法（表2）、超声波辅助提取法（表3）提取滇重楼多糖的最佳提取工艺。

表1 回流提取法正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test by the reflux extraction

表2 热水浸提法正交实验因素水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal test by the hot water extraction

表3 超声辅助提取法正交实验因素水平表Table 3 Factors and levels table of orthogonal test by the ultrasonic assisted extraction

2 结果与分析

2.1 回流提取法提取滇重楼多糖工艺的研究

单因素实验确定回流提取法提取滇重楼多糖的适宜条件为：料液比1∶60，提取时间1h，提取温度95℃，提取次数2次，在此基础上以提取率作为评价指标进行正交实验，结果见表4、表5。

由表4的正交实验极差分析结果可知，在考察的4个影响因素中，影响滇重楼多糖提取的主次顺序依次为：提取温度＞提取次数＞提取时间＞料液比；由表5的进一步方差分析得知，提取温度对滇重楼多糖得率的影响最大，达显著水平，其他3个因素水平对滇重楼多糖得率均有一定影响，差异未达到显著水平。根据正交实验结果，滇重楼多糖提取的最优组合为A2B2C3D3，即以1∶60的料液比，在95℃水浴条件下，提取3次，每次提取1h。

表4 回流提取法提取滇重楼多糖正交实验设计与结果Table 4 Orthogonal experimental design and results of extracting polysaccharide from Paris polyphylla var.yunnanensis by the reflux extraction

表5 回流提取法正交实验方差分析Table 5 Analysis of variance（ANOVA）of the orthogonal experiment for the reflux extraction

2.2 热水浸提法提取滇重楼多糖工艺的研究

单因素实验确定热水浸提法提取滇重楼多糖的适宜条件为：料液比1∶60，提取时间1.5h，提取温度85℃，提取次数2次，在此基础上以提取率作为评价指标进行正交实验，结果见表6、表7。

表7 热水浸提法正交实验方差分析Table 7 Analysis of variance（ANOVA）of the orthogonal experiment for the hot water extraction

由表6的正交实验极差分析结果可知，在考察的4个影响因素中，影响滇重楼多糖提取的主次顺序依次为：浸提时间＞料液比＞浸提次数＞浸提温度；由表7的进一步方差分析得知，浸提时间和料液比对滇重楼多糖得率的影响最大，达显著水平，而浸提次数对滇重楼多糖得率影响较小、浸提温度对滇重楼多糖得率影响最小，差异均未达到显著水平。根据正交实验结果，滇重楼多糖提取的最优组合为A3B2C2D2，即以1∶80的料液比，在85℃水浴条件下，提取2次，每次提取1.5h。

2.3 超声波辅助提取法提取滇重楼多糖工艺的研究

单因素实验确定超声波辅助（超声功率300W，工作频率40KHz）提取法提取滇重楼多糖的适宜条件为：料液比1∶20，超声时间1h，提取温度50℃，超声次数2次，在此基础上以提取率作为评价指标进行正交实验，结果见表8、表9。

表8 超声波辅助提取法提取滇重楼多糖正交实验设计与结果Table 8 Orthogonal experimental design and results of extracting polysaccharide from P.polyphylla var.yunnanensis by the ultrasonic assisted extraction

表9 超声波辅助提取法正交实验方差分析Table 9 Analysis of variance（ANOVA）of the orthogonal experiment for the ultrasonic assisted extraction

由表8的正交实验极差分析结果可知，在考察的4个影响因素中，影响滇重楼多糖提取的主次顺序依次为：超声温度＞料液比＞超声时间＞提取次数；由表9的进一步方差分析得知，超声温度、料液比、超声时间对滇重楼多糖得率的影响最大，达显著水平，而提取次数对滇重楼多糖得率影响最小，差异未达到显著水平。根据正交实验结果，滇重楼多糖提取的最优组合为A2B3C2D2，即以1∶50的料液比，在50℃水温条件下，提取2次，每次提取1.5h。

2.4 验证实验

由于回归正交实验得到的最佳提取工艺条件并不在正交实验表安排的实验中，需进一步做验证性实验，不同提取方法所得滇重楼多糖提取率见表10。结果表明，从滇重楼多糖得率、经济等方面考虑，超声波辅助提取法可明显降低提取能耗、节约试剂，占有一定优势。至于滇重楼多糖的各组分、单糖含量、分子量及生理活性等还有待进一步的研究。

表10 不同方法提取滇重楼多糖的比较（n=3）Table 10 Comparison among different methods of extracting polysaccharide from P.polyphylla var.yunnanensis（n=3）

3 结论与讨论

本实验比较了3种不同提取方法，从测定的滇重楼多糖含量来看，差异性不显著。运用回流提取法需要综合考虑经济成本，同时其提取率较低。该法所得工艺的最优组合是在95℃水浴条件下，以料液比1∶60（g∶mL），提取时间1h，提取3次，滇重楼多糖的平均提取率为18.72mg/g。热水浸提法是最能进行工业生产所用方法之一，实验所得工艺参数为在85℃水浴条件下，以1∶80（g∶mL）的料液比，提取2次，每次提取1.5h。滇重楼多糖提取率为23.84mg/g，且成本较低、操作方便，适宜于工产化生产。超声波辅助提取法的最优工艺参数为在50℃水温条件下，以1∶50（g∶mL）的料液比，提取2次，每次提取1.5h，滇重楼多糖的平均提取率为24.32mg/g，该法具有提取率高和适合于滇重楼多糖含量测定的样品前处理方法，可作为实验室科学研究的首选方法之一。综上所述，不同的提取工艺各具优势，在今后的研究和生产中可根据具体条件选择合适提取工艺进行。

本实验建立的3种提取工艺稳定可靠，定量分析方法灵敏、准确、重复性好，可为滇重楼多糖的工业化生产提供基础性技术资料，为滇重楼的精深加工提供技术支撑。

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Comparative studies on different extraction process of polysaccharide from Paris polyphylla var.yunnanensis

ZHOU Nong1，2，GUO Dong-qin1，WANG Kai-tuo1，ZHANG De-quan2，*，PENG Guo-hui1，ZHANG Chun-qin2
（1.College of Life Science and Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404000，China；2.College of Pharmacy，Dali University，Dali 671000，China）

Various extraction process of polysaccharide from Paris polyphylla var.yunnanensis was studied. Effect of the ratio of material to liquid，extraction time，extraction temperature and extraction times on extract rate of polysaccharide was studied.The best extraction process was determined by orthogonal experiment in case of the single factor condition.As a result，the best extraction process for reflux extraction method was to extract 3 times（1h/times）with the ratio of material to liquid for 1∶60（g∶mL）in 95℃water bath，and extraction rate of polysaccharide reached 18.72mg/g under the best condition.The best process for the hot water extraction method was to extract 2 times（1.5h/times）with the ratio of material to liquid for 1∶80（g∶mL）in 85℃water bath，and extraction rate of polysaccharide reached 23.84mg/g under the best condition.The best process for the ultrasonic assisted extraction method was to extract 2 times（1.5h/times）with the ratio of material to liquid for 1∶50（g∶mL）in 50℃water bath，and extraction rate of polysaccharide reached 24.32mg/g under the best condition.There was no significant difference among the three extraction methods to extraction efficiency of polysaccharide in P.polyphylla var.yunnanensis.

Parispolyphyllavar.yunnanensis；polysaccharide；orthogonaltest；refluxextraction；hotwaterextraction；ultrasonic assisted extraction

TS201.1

B

1002-0306（2014）14-0326-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.063

2013－10－09 *通讯联系人

周浓（1978-），男，副教授，主要从事药用植物栽培与质量控制方面的研究。

重庆市教委科学技术研究项目资助（KJ131109）；万州区科委自然科学基金项目（201301024）；国家自然科学基金资助项目（81260622）；重庆三峡学院科研创新团队建设计划（201302）。