响应面法优化小丛红景天多糖超声提取工艺研究

王 莉，赵 桦，马英丽，王 星（陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723000）

响应面法优化小丛红景天多糖超声提取工艺研究

王 莉，赵 桦*，马英丽，王 星
（陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723000）

为优化小丛红景天药材中水溶性多糖超声提取工艺，在单因素实验的基础上，利用响应面分析方法建立了小丛红景天多糖超声提取的二次响应曲面方程。实验证实提取温度、超声功率、提取时间和料液比对小丛红景天多糖提取有不同的影响。结果表明，在实验范围内通过方差分析可知各因素对小丛红景天多糖提取率影响的大小依次为超声提取温度、超声功率、料液比和超声提取时间。小丛红景天多糖超声提取工艺的最佳条件为：提取温度69℃、超声功率240W、料液比1∶30（g/mL），提取时间39min，在此条件下小丛红景天多糖提取率可达4.305%，与模型预测值高度相符。

小丛红景天，多糖，超声提取，响应面分析法

小丛红景天（Rhodiola dumulosa（Franch.）S.H. Fu），又名凤尾七、雾灵景天，系景天科多年生红景天属植物。红景天属植物在世界上有90余种，多分布在北半球的高寒地带，大多数都生长在海拔3500～5000m左右的高山流石或灌木丛林下，中国有73种2亚种7变种。主要分布在我国东北、华北、内蒙古、西北、西南、华中的神农架等地区[1]，属于天然珍贵药用植物，素有“高原人参”和“雪山仙草”之称，是陕西地道的药材“七药”之一[2-3]，具有滋阴补肾、养心安神、调经活血及明目等功效[2-3]。现代药学和药理学研究表明，小丛红景天的主要活性成分为黄酮、酚类、挥发油和微量元素等，具有延缓机体衰老、清除自由基、增强记忆、改善睡眠、防治老年疾病等功效，在军事医学、运动医学和保健医学等方面都具有广泛的应用[4-6]。小丛红景天药材含有一定量的多糖类化合物，我们已对其含量以及体外抗氧化、抑菌杀菌生物学活性进行了初步分析研究，研究结果表明小丛红景天多糖具有良好的体外抗氧化活性和抗菌抑菌活性，具有一定的开发和应用价值[7]。然而，目前有关小丛红景天多糖提取工艺的研究还未见报道。

近年来，现代提取技术超声提取法具有设备简单、操作时间短、提取效率高等优点，已广泛用于天然产物中有效成分的提取[8-11]。响应面分析法（Response surface analysis，RSA）是利用合理的实验设计，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，以回归分析寻求最优工艺的有效方法。目前，该分析法已经广泛应用在诸多工艺过程优化控制等领域[8-17]。本文以秦巴山区产小丛红景天植物为材料，采用微波辅助提取法，通过不同提取单因素实验，分析比较提取分离过程中各因素对多糖提取的影响，利用响应面分析法优化其多糖类化合物提取工艺。研究结果将丰富对小丛红景天药材的应用研究积累研究资料，同时也为小丛红景天植物资源的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小丛红景天药材 购自汉中药材市场，经汉中药检所彭强主任药师鉴定为景天科红景天属小丛红景天，实验材料用清水洗净，于50℃烘至恒重，粉碎过24目筛，密封保存。

UV-2550型紫外分光光度计 日本岛津；MS204-S型电子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；KQ-300DE型数控超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司；IKARV 10D型旋转蒸发仪 德国IKA公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小丛红景天中多糖提取的工艺流程 50℃烘干药材→粉碎过24目筛→45℃乙醚索氏提取脱脂至乙醚为无色，药渣挥干乙醚，置于圆底烧瓶中→95%乙醇回流提取90℃回流2h（去除单糖、低聚糖、苷类及生物碱等干扰成分）→抽滤→所得滤渣按一定液料比加蒸馏水→超声波浸提（按一定的超声波功率、超声波提取温度、超声波提取时间、提取次数浸提）→抽滤→滤液水浴浓缩→加入乙醇，使乙醇含量达到80%以上，直到不再产生新的沉淀为止，静置过夜→抽滤，回收乙醇→所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤→挥干溶剂后，50℃烘干，得到粗多糖→UV检测。

1.2.2 小丛红景天多糖含量测定 采用蒽酮—硫酸法测定小丛红景天植物中多糖含量[18]。

1.2.2.1 标准曲线的建立 精密称取烘至恒重的无水葡萄糖25mg，置于500mL容量瓶中，用无离子水溶解并定容至刻度，即配成50μg/mL的标准溶液。

分别精密吸取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL储备液置于试管中，加入1mL蒸馏水，再分别加入10mL 2g/mL的蒽酮-硫酸试剂（冰水浴中），摇匀，沸水浴15min，取出后于冰水浴中冷却至室温。在620nm处测吸光度[17]，以吸光度A为纵坐标，葡萄糖质量浓度C（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为：A=0.0032C+ 0.0008（R2=0.9995）。其浓度在20.00～100.00μg/mL范围内，线性关系良好。

1.2.2.2 样品制备 按1.2.1项下，称取小丛红景天药材粉末10.00g，提取小丛红景天粗多糖。

1.2.2.3 小丛红景天多糖含量检测 精密称取粗多糖粉末10mg，于100mL容量瓶中，用无离子水溶解并定容至刻度。精密吸取1mL于试管中，参照1.2.1同样显色操作处理，测定吸光值A。根据葡萄糖标准曲线可计算小丛红景天多糖的浓度C（小丛红景天多糖浓度以葡萄糖浓度计）和提取率。

式中：C为样品液中多糖的质量浓度（μg/mL）；N为稀释倍数；V为样品液的体积（mL）；M为样品质量（g）。

1.2.3 单因素实验 准确称取小丛红景天粉末10.00g，在其他条件相同的情况下，采用不同液料比、超声功率、超声提取时间、超声提取温度和超声提取次数进行超声辅助提取，以小丛红景天多糖提取率为响应值，逐个考察各提取条件对提取效果的影响。

1.2.4 响应面实验设计 在单因素实验结果的基础上，采用响应面分析法，根据Box-Behnken的中心组合原理[11]，固定超声提取次数为2次，选取料液比X1、超声功率X2、提取时间X3、提取温度X4共4个对多糖的提取影响显著的因素，以小丛红景天多糖提取率为响应值，采用4因素3水平的响应面分析法，得到二次回归方程，以确定小丛红景天多糖的最佳工艺条件并进行验证。实验设计如表1所示。

表1 响应面分析因素与水平表Table 1 Variables and levels in response surface design

所有的实验均重复3次，利用统计分析软件Design Expert 8.0及Excel程序对实验结果进行分析。

图1 料液比对小丛红景天多糖提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of R.dumulosa polysaccharides

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对小丛红景天多糖提取率的影响 精密称取小丛红景天粉末10.00g，按提取温度为70℃，提取时间为30min，超声波输出功率为210W，超声波提取次数为2次的条件下，分别将料液比设为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40这五个水平，每个水平做三个重复实验，以考察料液比对小丛红景天多糖提取率的影响。结果如图1所示。

由图1可知，多糖提取率随着料液比的改变而变化，在1∶20～1∶30（g/mL）的范围内尤为明显。当料液比达到1∶30后，随着料液比的继续增大，多糖提取率递增的趋势不明显。液料比越大，多糖提取率越高，其原因是提取液体积越大，溶剂与浸提物的接触越充分，能在相同时间内溶解出更多的水溶性多糖，使提取率增大。当溶液量继续增加，料液比达1∶30后，曲线趋于平缓，说明多糖溶解基本饱和。如果液料比过小，就没有足够的溶剂带出药材颗粒中的多糖，从而使提取率降低。如果料液比过大，会消耗更多的能量和时间，同时也会增加超声波破碎细胞的阻力，使细胞破碎程度下降，从而降低有效成分的提取率，因此液料比为1∶30（g/mL）较适宜。

2.1.2 超声功率对小丛红景天多糖提取率的影响 精密称取小丛红景天粉末10.00g，按料液比1∶30，提取时间为30min，提取温度为70℃，超声波提取次数为2次的条件下，分别将超声功率设为150、180、210、240、270W这五个水平，每个水平做三个重复实验，以考察超声功率对小丛红景天多糖提取率的影响。结果如图2所示。

图2 超声功率对小丛红景天多糖提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction yield of R.dumulosa polysaccharides

由图2可知，在超声波功率150～240W范围内，小丛红景天多糖提取率随着超声波功率的增大而提高，这是因为随着功率的增加，超声波对细胞壁的破碎作用增强，胞内多糖溶出速率增大，溶液中多糖的含量也逐渐增加。在240～270W之间，随着超声波功率的增大，多糖提取率下降，其主要原因是当超声功率大于240W时，超声作用进一步加速了提取液的流动，从而减少了物料在超声场中的停留时间，破壁作用也随之减弱，同时功率过大可能会使多糖分子降解程度加大。因此，选择超声波功率为240W左右为宜。

2.1.3 超声提取时间对小丛红景天多糖提取率的影响 精密称取小丛红景天粉末10.00g，按料液比1∶30，提取温度为70℃，超声波输出功率为210W，超声波提取次数为2次的条件下，分别将提取时间设为10、20、30、40、50min这五个水平，每个水平做三个重复实验，以考察超声提取时间对小丛红景天多糖提取率的影响。结果如图3所示。

图3 超声提取时间对小丛红景天多糖提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of R.dumulosa polysaccharides

由图3可知，在超声时间低于40min时小丛红景天多糖提取率提高比较明显，以后增加趋于平缓。这表明，小丛红景天多糖浸出过程与时间密切相关，时间过短，产物溶解不充分，多糖提取率较低，但随着提取时间超过40min时后，多糖提取率不再提高。这是因为超声波具有较强的机械剪切作用，长时间的作用会使大分子的多糖断裂，从而在后处理的过程中损失增大而影响多糖的提取率。因此，选择超声提取时间为40min左右为宜。

2.1.4 超声提取温度对小丛红景天多糖提取率的影响 精密称取小丛红景天粉末10.00g，按料液比1∶30，提取时间为30min，超声波输出功率为210W，超声波提取次数为2次的条件下，分别将提取温度设为40、50、60、70、80℃这五个水平，每个水平做三个重复实验，以考察超声提取温度对小丛红景天多糖提取率的影响。结果如图4所示。

图4 超声提取温度对小丛红景天多糖提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield of R.dumulosa polysaccharides

由图4可知，在40～70℃之间，小丛红景天多糖提取率随提取温度的升高不断提高，达到70℃时，多糖提取率达到最高，超过70℃后多糖的提取率开始降低。这可能是因为温度过低时，多糖不能有效地溶出；提取温度升高会加快溶液的扩散速率，促进细胞内的多糖物质向外扩散。而温度太高，则部分多糖降解，提取率随之降低。因此，选择超声提取温度为70℃左右为宜。

2.1.5 提取次数对小丛红景天多糖提取率的影响 精密称取小丛红景天粉末10.00g，按料液比1∶30，提取时间为30min，提取温度为70℃，超声波输出功率为210W的条件下，分别将提取次数设为1、2、3、4、5次这五个水平，每个水平做三个重复实验，以考察提取次数对小丛红景天多糖提取率的影响。结果如图5所示。

图5 超声提取次数对小丛红景天多糖提取率的影响Fig.5 Effect of the number of repeated extraction on extraction yield of R.dumulosa polysaccharides

由图5可知，随着超声提取次数的增加，多糖提取率也随之不断提高。在第3、4、5次提取率的变化不明显，考虑到工业生产成本，且次数对多糖提取率影响不大，故最佳提取次数选为2次。

2.2 响应面实验结果与数据分析

2.2.1 二次回归模型拟合及方差分析 由Design Expert 8.0统计分析软件的实验设计功能可知，四因素二次回归旋转组合设计包括29个实验方案，具体实验方案及实验结果如表2所示。表中1～24号是析因实验，25～29号是中心实验。29个实验点为分析因点和零点，其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点实验重复5次，用以估计实验误差。

用软件Design Expert 8.0对所得数据进行回归分析，回归分析结果见表3。对各因素回归拟合后，得到回归方程：

Y（%）=-98.05503+0.26602X3+0.34279X2+ 1.36860X4+0.51797X1+0.00067X3X2-0.00018X3X4-0.00028X1X3-0.00087X2X4+0.00036X2X1-0.00066X42-0.00506X32-0.00066X22-0.00821X42-0.00885X12。

从表3可以看出，用上述回归方程描述各因素与响应值的关系时，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著（r=模型平方和/总离差平方和=0.9763），模型的显著水平p＜0.0001，说明此模型高度显著，与实际实验拟合良好，实验误差小，该实验方法可靠。回归方程各项方差分析，当显著水平p＜0.05时，它所对应的条件对响应值的作用是显著的，方程的失拟误差不显著，可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。结果表明，料液比（X1）、超声功率（X2）、提取温度（X4）、超声功率与提取时间相互作用（X2X3）、超声功率与提取温度相互作用（X2X4）、料液比二次项（X12）、超声时间二次项（X22）、提取时间二次项（X32）、提取温度二次项（X42）对实验结果影响显著。因此，各实验因子对响应值的影响不是线性关系。对小丛红景天多糖提取率影响的大小依次为超声提取温度＞超声功率＞料液比＞超声提取时间，即超声提取温度对小丛红景天多糖提取率的影响最为显著。

表2 响应面分析方案及实验结果Table 2 Arrangement and experimental results of response surface central composite design

2.2.2 响应面交互作用分析与优化 RSM方法的图形是特定的响应面Y对应的因素料液比（X1）、超声功率（X2）、提取时间（X3）、提取温度（X4）构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，可以直观地反映各因素对响应值的影响，从实验所得的响应面分析图上可以找到它们在反应过程中的相互作用。回归优化响应面曲面图见图6～图11。

响应曲面图表现为曲线越陡，则说明该因素对多糖提取率的影响越显著。而其表现为曲线平滑，则说明影响不显著，并且随其数值的增加或减少，响应值变化较小。因此，由图6～图11可知，超声提取温度（X4）对小丛红景天多糖提取的影响最显著，超声功率（X2）次之，最后为料液比（X1）和超声提取时间（X3）；超声提取时间（X3）与超声功率（X2）交互作用显著、超声提取时间（X2）与超声提取温度（X4）交互作用显著、超声提取时间（X4）与料液比（X1）交互作用不显著、超声提取温度（X4）与超声功率（X3）交互作用不显著、料液比（X1）与超声功率（X2）交互作用不显著、料液比（X1）与超声提取温度（X3）交互作用不显著，与表3中交互项p值的分析结果一致。

表3 回归模型方差分析Table 3 ANONA（analysis of variance）of tems of regression equation

图6 提取时间与超声功率对多糖提取率的影响Fig.6 Response surface plot of the effects of extraction time and ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides

图7 提取时间与提取温度对多糖提取率的影响Fig.7 Response surface plot of the effects of extraction time and extraction temperature on extraction yield of polysaccharides

图8 提取时间与料液比对多糖提取率的影响Fig.8 Response surface plot of the effects of extraction time and solid-liquid ratio on extraction yield of polysaccharides

图9 提取温度与超声功率对多糖提取率的影响Fig.9 Response surface plot of the effects of extraction temperature and ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides

2.3 验证实验

回归模型预测的小丛红景天多糖提取最佳工艺条件为：提取温度68.84℃、超声功率244.05W、料液比1∶31.04，提取时间40.07min，在此条件下小丛红景天多糖提取率可达4.30939%。考虑到实际操作，将最佳工艺修正为提取温度69℃、超声功率240W、料液比1∶30，提取2次，每次39min。在此条件下称取小丛红景天干燥粉末3份，进行三组验证性实验。验证实验结果见表4。

图10 料液比与超声功率对多糖提取率的影响Fig.10 Response surface plot of the effects of water/material ratio and ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides

表4 验证实验结果（n=3）Table 4 Experimental results of verification（n=3）

由表4可知，实际测得小丛红景天多糖平均提取率为4.305%，与模型预测值高度相符。

3 结论

各因素对小丛红景天多糖提取率影响的大小依次为超声提取温度、超声功率、料液比和超声提取时间，即超声提取温度对小丛红景天多糖提取率的影响最为显著。

通过响应面法优化得到小丛红景天多糖的超声辅助提取最优工艺条件为提取温度69℃、超声功率240W、料液比1∶30，提取2次，提取时间39min，在此条件下小丛红景天多糖提取率可达4.305%。本研究结果为小丛红景天多糖的研究及小丛红景天植物的开发与利用提供了一定的参考。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from Rhodiola dumulosa（Franch.）S.H.F.by response surface analysis

WANG Li，ZHAO Hua*，MA Ying-li，WANG Xing
（School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China）

In order to optimize the conditions of ultrasonic-assisted extraction method of polysaccharides from Rhodiola dumulosa（Franch.）S.H.F.，on the base of single-factor experiment，an equation for the ultrasonic wave extraction was built.The experimence showed that extraction temperature，ultrasonic power，extraction time and liquid-solid ratio had different effects on the extraction yield of polysaccharides．The result indicated that within tested level ranges，the importance of four process parameters affecting extraction yield of polysaccharides order was ultrasonic treatment temperature，ultrasonic power，solid-liquid ratio and ultrasonic treatment time.The optimum conditions of the ultrasonic wave extraction of R.dumulosa polysaccharides were as follows：temperature 69℃，extraction ultrasonic power 240W，solid-liquid ratio 1∶30（g/mL）and extraction time 39min，the extraction rate of R.dumulosa polysaccharides could be up to 4.305%，exhibiting a good agreement with the predicted values.

Rhodiola dumulosa（Franch.）S.H.F.；polysaccharides；ultrasonic extraction；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2014）14-0315-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.061

2013-09-28 *通讯联系人

王莉（1987-），女，在读硕士研究生，研究方向：植物资源开发利用研究。

陕西省教育厅专项科研计划项目（12JK0842）；陕西省重点学科专项建设经费资助（2013）。