杏鲍菇产漆酶培养条件优化及其对菲的降解特性研究

葛 飞，张慧敏，龚 倩，朱龙宝，李婉珍，桂 琳（.安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖4000；.皖南医学院微生物与免疫学教研室，安徽芜湖4000）

杏鲍菇产漆酶培养条件优化及其对菲的降解特性研究

葛 飞1，张慧敏1，龚 倩1，朱龙宝1，李婉珍1，桂 琳2
（1.安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖241000；2.皖南医学院微生物与免疫学教研室，安徽芜湖241000）

在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken实验设计方法，以漆酶酶活为响应值，对杏鲍菇发酵产漆酶培养条件进行优化，并经实验验证模型的可行性。最终得到优化后的产酶条件为：转速131r/min，装液量32mL，温度27.6℃；在此条件下杏鲍菇对菲具有较高的降解率，培养12d后，菲降解率达82.86%。

杏鲍菇，漆酶，培养条件，响应面法，菲

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）属真菌门，担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，又名刺芹侧耳[1]。漆酶（EC1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，该酶在白腐真菌中普遍存在，多为分泌型糖蛋白[2]。漆酶首次是从日本漆树的汁液中分离而得到的，所以得名漆酶[3]。有关漆酶的研究报道已有一百多年的历史[4]，由于漆酶具有广泛的底物专一性和较好的稳定性，可以转化多环芳香化合物类、氯代酚类、多氯联苯类、二氯苯胺类等多种难降解的有机化合物[2]，所以它在食品工业、废水处理、生物漂白、芳香化合物转化、环境监测等方面都具有重要的应用价值[5]。

菲（Phe）是多环芳香化合物中的一种，由3个苯环构成，在环境中广泛分布，具有致癌、致畸、致突变的化学结构域，可诱发鱼类和其他生物的癌变、畸变和突变[6]。菲本身并没有明显的致癌性，但是其衍生物大都具有弱或中等强度的致癌性；同时，菲因兼具K区和湾区结构，因此是致癌多环芳烃的最小结构单元[7]，所以常作为微生物降解多环芳烃的研究模型。

响应面法（RSM）是一种最优化方法[8]，被广泛应用于实验最优化条件的寻找。范文霞等[9]将响应面法应用于毛云芝菌产漆酶培养条件的优化；Balan Kannan等[10]应用响应面法优化影响佛罗里达侧耳染料脱色过程的主要参数；并分别经实验验证了模型的可行性。

目前国内有关杏鲍菇降解多环芳烃方面的研究较少，因此，本研究选择高产漆酶杏鲍菇菌株，采用响应面法对该菌株产漆酶的培养条件进行了优化，在优化产酶条件下研究该菌株对多环芳烃菲的降解特性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杏鲍菇菌株 由安徽工程大学生物与化学工程学院310实验室保藏；菲 阿拉丁试剂；其余试剂 均为国产分析纯；土豆 购于芜湖市场；固体培养基土豆20%，葡萄糖2%，琼脂1.5%，MgSO40.15%，KH2PO40.3%，自然pH；液体培养基 土豆20%，葡萄糖2%，酵母膏0.5%，MgSO40.15%，KH2PO40.3%，VB10.001%，自然pH。

QHZ-123B型组合式全温度振荡培养箱 江苏省太仓市华美生化仪器厂；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；HH-6型数显恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司；L5型紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；L550型台式低速离心机、TG16-W微量高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ-250DE型医用数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；FA2204B电子天平 上海佑科。

1.2 菌种扩大培养

将杏鲍菇从斜面接种于固体培养基的平板上，28℃条件下静置培养10d，至菌丝布满平板。

1.3 液体培养方法

用无菌打孔器从菌丝平板上取直径10mm菌片，每个三角瓶接两片。将接种后的三角瓶置于恒温振荡培养箱进行液体培养。

1.4 漆酶活力测定方法[11]——愈创木酚法

酶活单位定义：1min内催化氧化1nmol愈创木酚的酶量为1个酶活单位（U）。愈创木酚基础反应液配制方法：准确称取4.5g丁二酸，适量蒸馏水溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH至4.5，取137.4μL愈创木酚，少量95%乙醇溶解，蒸馏水定容至1000mL。3mL反应体系包含2.4mL愈创木酚基础反应液、0.6mL酶液，30℃水浴中反应30min，于465nm处测定吸光度，以愈创木酚基础反应液为对照。酶活（U/mL）=13.8×吸光度（30min时）。

粗酶液的制备：取1mL发酵液，经9000r/min离心5min，上清液即为粗酶液。

1.5 单因素实验

1.5.1 摇床转速的优化 在1.1中液体基础培养配方、自然pH、培养温度25℃、摇瓶装液量30mL/100mL条件下，培养20d，其间对漆酶活性峰值进行监测，考察不同摇床转速80、110、140、170、200r/min对发酵液中漆酶合成的影响。

1.5.2 摇瓶装液量的优化 在1.1中液体基础培养配方、自然pH、培养温度25℃、140r/min条件下，培养20d，其间对漆酶活性峰值进行监测，考察100mL三角瓶装液量为20、30、40、50、60mL时对发酵液中漆酶合成的影响。

1.5.3 培养温度的优化 在1.1中液体基础培养配方、自然pH、摇床转速140r/min、摇瓶装液量30mL/ 100mL条件下，培养20d，其间对漆酶活性峰值进行监测，考察不同培养温度24、28、32、36℃对发酵液中漆酶合成的影响。

1.6 响应面优化实验

根据单因素实验确定的影响杏鲍菇漆酶活性的主要因素进行Box-Behnken设计。实验设计为三因素三水平，响应值Y为杏鲍菇漆酶活性（U/mL），并用Design-Expert软件对实验数据进行分析。因素水平见表1。

1.7 培养基中菲的添加方法

准确称取一定量菲溶于甲醇，配成10mg/mL的菲浓缩液。100mL空三角瓶灭菌烘干，于无菌操作台加入0.32mL菲浓缩液，待甲醇完全挥发，加入32mL灭菌培养基，培养基中菲浓度为100mg/L。

1.8 培养液中残留菲测定方法

每次都是整瓶萃取，12d结束培养，量取等体积的环己烷加入培养液（包含杏鲍菇菌丝体）中，充分振荡后，超声波萃取30min，待液体分层。用移液枪移取一定量上清液，经适当稀释在252nm处，测定其吸光值，对照菲标准曲线（y=0.327x，相关系数R2=0.9995，y为吸光值，x为浓度），得出菲的浓度。降解率D（%）=（Cck-Cf）/Cck×100，残留率R（%）=Cf/Cck×100，降解速率S（%）=D（%）/d，其中，Cf为培养液中残留菲的浓度，Cck为空白对照菲的浓度，d为培养天数。超声波提取法是美国EPA推荐的多环芳烃提取方法之一，具有操作简单、省时、溶剂用量相对较少、萃取效率高等特点，同时超声波提取还可以打碎细胞，提取出菌体内吸附的多环芳烃[12]。

1.9 生物量的测定

采用菌体干重法，培养液经4000r/min离心15min，菌丝体于106℃烘干3h至恒重，测干重（a），扣除琼脂片重量（b），即为菌体干重（c），即c=a-b。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验优化培养条件

2.1.1 摇床转速的优化 由图1可知，随着转速的增大，漆酶活性先增后减。摇床转速为140r/min时，漆酶活性最大，摇床转速为200r/min时，漆酶活性最低。分析原因可能是随着转速的增加，水的剪切力增大，影响到了菌体的产酶；而转速过低时，由于培养液溶氧量减少，也会影响到菌体的产酶。

图1 不同转速条件下漆酶活性Fig.1 Laccase activity under different speed

2.1.2 摇瓶装液量的优化 由图2可知，随着装液量的增加，漆酶活性也表现为先增后减的趋势，当装液量为30mL时，漆酶活性最高。分析原因可能是100mL容积的三角瓶装液量小于30mL时，菌体所利用的营养物质较少，漆酶活性不高；当装液量超过40mL时，振荡培养过程中的氧气不能满足菌株的生长所需，菌株的生长受到抑制，进而影响到漆酶活性。

图2 不同装液量条件下漆酶活性Fig.2 Laccase activity under different liquid volume

2.1.3 培养温度的优化 由图3可知，随着温度的升高，菌株漆酶活性呈现出先增后减的趋势，温度为28℃时，漆酶活性最高。温度过高或过低都会影响菌株产酶，而高温对菌株的影响特别严重，当温度为36℃时，菌株完全不能生长，经测定无漆酶活性。分析原因可能是菌体的生长代谢依靠各种酶类，而它们都有适当的温度范围。

图3 不同温度条件下漆酶活性Fig.3 Laccase activity under different temperature

2.2 Box-Behnken响应面实验结果与分析

Box-Behnken响应面实验设计及结果见表2。

以Y（漆酶活性）为响应值，用Design-Expert软件对表2中的实验结果进行分析，得到三元二次回归方程：Y=50.51-1.59A+1.63B-2.33C+1.20AB+1.50AC+ 0.13BC-4.58A2-4.10B2-14.42C2。实验结果的方差分析见表3。

由表3的结果分析可知，该模型极显著（p=0.0001），在模型各参数中，A、B、C、A2、B2、C2系数的置信度均在95%水平以上，说明它们在本实验中均是显著项，即转速（A）、装液量（B）和温度（C）都是对实验结果影响较大的因子。该模型相关系数R2=99.12%、调整相关系数R2=97.52%、预测相关系数R2=95.08%，表明该模型的预测值与实验值拟合良好，并能做出相对准确的预测。变异系数CV=3.47%，表明实验数据可靠，分析结果真实可信。

表2 Box-Behnken响应面实验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken

表3 Box-Behnken Design响应面实验方差分析表Table 3 Variance analysis table of Box-Behnken

2.3 最适培养条件的确定

运用Design-Expert软件对回归模型进行响应面分析，得到转速（A）、装液量（B）和温度（C）三个因素两两之间响应面立体分析图（见图4～图6）。曲面图可以直观地反映出各因素及其交互作用对响应值的影响，曲面的倾斜度越高，说明两者交互作用越显著，另外随着变化趋势的剧烈增加，颜色也呈现加深的趋势。等高线可以直观地反映出两变量交互作用的显著程度，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形表示两因素交互作用显著。

由响应面方差分析和漆酶活性响应曲面图可以看出，转速（A）和温度（C）形成的交互作用比较明显，接近显著；转速（A）和装液量（B）、装液量（B）和温度（C）形成的交互作用不显著。从响应曲面的最高点可以看出，在所选范围内存在极值，既是响应曲面的最高点，同时也是等值线最小椭圆的中心点。转速（A）、装液量（B）和温度（C）三个因素在一定的条件下，形成最佳组合，使漆酶活性达到极值。

图4 转速（A）和装液量（B）交互影响漆酶活性的响应曲面图Fig.4 RSD figures of speed（A）and liquid volume（B）interacting on laccase activity

图5 转速（A）和温度（C）交互影响漆酶活性的响应曲面图Fig.5 RSD figures of speed（A）and temperature（C）interacting on Laccase activity

图6 装液量（B）温度（C）交互影响漆酶活性的响应曲面图Fig.6 RSD figures of liquid volume（B）and temperature（C）interacting on Laccase activity

对响应面分析得到的回归方程的各个自变量分别进行一阶偏导，得到一个三元一次方程组，求解得A=-0.3132，B=0.2776，C=-0.1874，即三个因素的最佳组合为转速131r/min，装液量32mL，温度27.6℃，在此条件下预测得到漆酶活性最大值为53.15U/mL。

为了验证模型的可行性，采用响应面分析所得最优条件进行实验，分别设三个平行，经实验得到实际酶活平均值为52.42U/mL，与预测值相比，相对误差在2%以内，证明该模型拟合较好。因此，采用响应面分析法优化得到的杏鲍菇的培养条件准确可靠，具有实际运用价值。

2.4 杏鲍菇对菲的降解特性

响应面优化的最佳产酶条件下，研究了该菌株对菲的降解特性。结果如下：

2.4.1 菌株菲降解曲线和生物量变化研究 由图7可知，菌株生长的第1～5d，培养液中菲的残留率较高，均在70%以上，且变化幅度较小；从第7d开始，菲的残留率明显降低，并且很快趋于平稳。从第11～19d菲的残留率变化幅度很小，分析原因可能是因为培养基中的营养物质消耗殆尽，菌体衰亡所致。同时，从生物量变化图上可以看出，第13d生物量达到最大，随着营养物质的耗尽，菌体生物量逐渐下降，菲残留率趋于稳定。

图7 不同培养时间菲残留率与生物量变化Fig.7 Phenanthrene residue rate and biomass variation in different incubation time

2.4.2 菌株漆酶活力与菲降解相关性研究 由图8可知，培养的前13d，杏鲍菇漆酶的活力与菲降解率之间有明显的正相关性。菲降解速率最大的时间段也是漆酶活力增加值最多的时间段。培养后期由于培养基营养的消耗，菌体的衰亡，漆酶活力显著下降，菲降解速率也随之明显下降，表现为降解曲线趋于平稳。

图8 漆酶活性与菲降解率曲线Fig.8 Curve of laccase activity and phenanthrene degradation rate

2.4.3 菲对菌株产漆酶的影响 由图9可知，在菌株生长的1～5d，有菲培养条件下漆酶活性较无菲培养条件下低，分析原因可能是菲对菌体具有一定的毒性，会对菌体产生抑制作用，但是随着菌体的生长，其对菲的毒性逐渐适应，并且对其开始分解利用。在有菲培养中酶活峰值出现在培养的第11d，而在无菲培养中酶活峰值出现在培养的第13d，有菲条件下明显高于无菲条件下，峰值分别为53.204U/mL和49.402U/mL，并且在有菲条件下酶活峰值维持时间较长，分析原因可能是菲的毒性在另一方面又成为漆酶活性的刺激物，使其分泌量增加。

图9 菲对菌株产酶影响比较Fig.9 Comparison of laccase production effect of phenanthrene

2.4.4 不同初始pH条件下菌株对菲的降解情况 初始pH对菲的降解率影响很大，pH为4.0时，菌株完全不能生长，菲降解率为0。pH在5.5～6.5范围内，菌株生长情况良好，菲的降解率接近。超过6.5时，降解率有下降的趋势。

图10 不同初始pH条件下菲降解率比较Fig.10 Comparison of phenanthrene degradation rate under different initial conditions of pH

2.4.5 菌株对不同浓度菲的降解特性 由图11可知，高浓度的菲对菌株的生长没有抑制作用，菲浓度在0～800mg/L范围内，随着菲浓度的增大，菲的降解率明显下降；对生物量的测定结果表明：菲浓度在0～800mg/L范围内，菌株的生长状况良好，其最大生物量接近，都在12.50g/L左右。

3 结论

为了提高杏鲍菇漆酶的活性，本实验首先通过单因素实验确定了发酵培养基的摇床转速、装液量以及温度，在此基础上采用Box-Behnken设计，进行三因素三水平实验。通过Design-Expert软件进行分析，得到优化后的产酶条件为：转速131r/min，装液量32%，温度27.6℃。在此优化产酶条件下研究了该菌株对多环芳烃菲的降解特性，结果表明：杏鲍菇在pH5.5～6.5范围内，对多环芳烃菲具有较高的降解率，12d的菲降解率达到82.86%，适量菲的添加能够刺激菌体产酶，并且该菌株对高浓度菲的耐受性很强，在高浓度菲的条件下生长状况良好。

图11 不同起始菲浓度条件下菲降解率和生物量Fig.11 Phenanthrene degradation rate and biomass under different initial concentration conditions

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Optimization of culture conditions of Pleurotus eryngii for laccase production and its degradation characteristics of phenanthrene

GE Fei1，ZHANG Hui-min1，GONG Qian1，ZHU Long-bao1，LI Wan-zhen1，GUI Lin2
（1.Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation Anhui Province，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China；2.Department of Microbiology and Immunology，Wannan Medical College，Wuhu 241000，China）

Based on the single factor experiment，using Box-Behnken experimental design method，the enzyme activity of laccase as response value，the fermentation conditions were optimized and the feasibility of experiment model was validated.The results indicated optimal ingredients including：the speed at 131r/min，temperature at 27.6℃ and shake loading at 32mL/100mL.Under the optimal conditions，the strain of Pleurotus eryngii had higher degradation rate of phenanthrene.The degradation rate of phenanthrene reached 82.86%at the 12th day.

Pleurotus eryngii；laccase；culture conditions；response surface methodology；phenanthrene

TS201.3

A

1002-0306（2014）14-0221-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.040

2013－10－24

葛飞（1978-），男，博士，副教授，研究方向：微生物资源开发与利用。

安徽省高等学校优秀青年人才基金项目（2011SQRL079）；安徽高校省级自然科学研究项目（KJ2013A049）。