过敏组学的研究概况及其在食物过敏中的应用

佟 平，胡艳连，高金燕，李 欣，，杨安树，吴志华，，陈红兵，，*（.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌007；.江西省宜春市人民医院，江西宜春6000；.南昌大学生命科学与食品工程学院，江西南昌007；.南昌大学中德联合研究院，江西南昌007）

过敏组学的研究概况及其在食物过敏中的应用

佟 平1，胡艳连2，高金燕3，李 欣1，3，杨安树4，吴志华1，4，陈红兵1，4，*
（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047；2.江西省宜春市人民医院，江西宜春336000；3.南昌大学生命科学与食品工程学院，江西南昌330047；4.南昌大学中德联合研究院，江西南昌330047）

近年来，食物过敏现象日益普遍，引起过敏的蛋白日益受到关注，过敏组学应运而生。本文就过敏组学的概念、过敏组学的研究方法以及过敏组学在食物过敏中的应用做了介绍。

过敏组学，过敏原，食物过敏

组学技术是近年来在生物及医学领域快速发展，并受到高度重视的现代分析技术。“组”的概念来源于希腊语，最初用于基因组，指一个物种的全部遗传组成。发展到现在，“组”的使用已经扩展到其他相关领域，如蛋白质组、代谢组等。随着过敏现象的日益增多，过敏原蛋白日益受到关注，人们对过敏原蛋白开展了大量的研究，过敏组学应运而生。

1 过敏组学概念的提出

过敏组学（allergenomics）的概念最早见诸于文献是在2004年的《International Archives of Allergy and Immunology》杂志上，由Yagami等提出[1]。他们指出传统的分析过敏原蛋白的方法通常是先分离出各个过敏原蛋白，然后对过敏原蛋白进行鉴定，再对其致敏性进行表征。这一过程非常繁琐、耗时，并且工作量大。而随着蛋白质组学技术的发展，以及蛋白质序列库的完善，运用蛋白质组学技术来分析潜在的过敏原成分将会是一种简单快速的方法。他们通过运用蛋白质组学技术对乳胶中的潜在过敏原进行识别验证，证实了运用蛋白质组学的方法研究过敏原是一种快速全面分析潜在过敏原的有效途径。因此，他们结合了过敏原（allergen）和蛋白质组学（proteomics）两个单词，提出过敏组学（allergenomics）这一概念，即运用蛋白质组学方法来解析过敏原蛋白的一门学问。随后，过敏组学概念开始被引用。

2 过敏组学常用的研究方法

过敏组学的研究方法包括蛋白质组学研究的三大支柱技术——双向电泳（two-dimensional electrophoresis，2-D电泳）、质谱（mass spectrometry，MS）和生物信息学，以及免疫学技术——免疫印迹。其中，以2-D电泳、免疫印迹技术和MS技术为支撑平台，用于过敏原蛋白的分离、鉴定，以生物信息学为桥梁，利用计算机系统和生物学软件进行大规模的数据处理，对潜在的过敏原蛋白进行解析。

2.1 双向电泳

2-D电泳是20世纪70年代O’Farrell建立的蛋白质分离技术[2]，是等电聚焦电泳（isoelectric focusing，IEF）和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophresis，SDS-PAGE）的组合，即先利用IEF的方法分离等电点不同的蛋白质，再通过SDS-PAGE将分子量不同的蛋白质在二维平面上分开，从而达到有效分离蛋白质的目的。最初，由于IEF在两性电解质胶管中进行，存在操作复杂、聚焦时间长、pH不稳定、阴性漂移等缺陷，自20世纪80年代开始，通过采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点，并且可随意精确设定pH梯度，提高了实验的稳定性、重复性及分辨率，这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。

2.2 免疫印迹

免疫印迹技术是一种将凝胶电泳和免疫分析技术有机地融为一体的分析技术，是蛋白电泳技术的延伸和发展。该技术由Towbin等首次介绍[3]，随后被迅速传播，应用非常广泛。其原理是混合样品经凝胶电泳后分离，凝胶中的蛋白质用电印迹方法被转移到化学惰性的高分子转移膜上。然后，将目的蛋白的特异性一级抗体（一抗）与转移膜上的目的蛋白进行免疫结合反应，再用标记过（如辣根过氧化物酶标记）的二级抗体（二抗）与一抗结合，利用对二抗分子中标记物的检测证明目的蛋白的存在。

2.3 质谱

质谱是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱，由Thomson发明。其原理[4]是将样品离子化后，根据各离子间质荷比（m/z）的差异分离蛋白质，并确定其相对分子质量，能快速、准确地鉴定蛋白质组分，并准确测定肽和蛋白质的相对分子质量、氨基酸序列和翻译后的修饰，具有高通量、灵敏度和准确度高、易于自动化等特点，是蛋白质组学、也是过敏组学最主要的鉴定技术。依据蛋白质鉴定质谱电离源的不同分为两种：基质辅助激光解吸飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDITOF-MS）和电喷雾离子串联质谱（electrospray ionization tandem mass spectrometry，ESI-MS-MS），前者利用吸收激光的能量使固相的多肽样品离子化，得到酶解肽段的分子量，获得蛋白质的肽质量指纹图谱，通过相应的数据库鉴定蛋白质，特别适用于分析多肽和蛋白质的混合物；后者则在喷射过程中利用电场，使液相的多肽样品离子化，采用串联质谱的方法，进行肽的测序，不仅能获得肽段质量，而且能获得肽段氨基酸序列信息。目前，这两种质谱在过敏组学中都有广泛的应用。

2.4 生物信息学

生物信息学的核心是蛋白质数据库的建立和完善。通过对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索与分析，解释数据所蕴含的生物学意义，同时为蛋白质的鉴定、结构分析和功能预测提供依据。生物信息学技术与蛋白质组学技术结合主要对差异蛋白质进行筛选和鉴定。许多国家和地区的研究机构都建立了自己的蛋白质数据库，其中最具代表性的是SWISSPROT，为世界上使用最广泛的蛋白质序列数据库[4]，可提供蛋白质的功能、结构域、翻译后的修饰、突变体的描述等信息，并且这些信息会及时更新。

3 过敏组学在食物过敏中的应用

3.1 识别潜在的食物过敏原

运用过敏组学技术识别潜在的过敏原，主要是利用2-D电泳与免疫印迹相结合，首先复杂蛋白质混合物通过IEF和SDS-PAGE电泳有效分离，再通过电转技术将分离的蛋白转移至PVDF膜上，然后利用过敏患者血清来检测与过敏患者血清中IgE结合的蛋白，从而确定潜在的致敏蛋白。这种方法可有效地分离蛋白，同时可全面检测出多种与IgE结合的潜在过敏蛋白。在此基础上，结合质谱技术可对识别的潜在过敏原蛋白进行定性分析，通过比对蛋白质数据库，鉴定出潜在过敏原的蛋白质种类。目前该组合技术已广泛被应用。如Beyer等利用2-D免疫印迹与质谱测序的方式鉴别出了榛子过敏原Cor a 9[5]。Pastorello等也利用该组合技术鉴别出了6种玉米过敏原，并发现其中两种过敏原与葡萄可能存在交叉反应[6]。Boldt等[7]和Chassaigne等[8]分别利用2-D电泳和不同的质谱方法鉴别出了花生过敏原Ara h 1，Ara h 2，Ara h 3，Ara h 4及Ara h 3的同分异构体。Akagawa等[9]和Sotkovský等[10]也分别利用不同的质谱技术分别鉴别出了4种小麦过敏原和19种小麦过敏原。此外，该技术还被用于鉴别虾[11]、鸡蛋[12]过敏原，以及一些不常引起过敏的食物中的过敏原，比如桃子[13]、板栗[14]、西红柿[15]、莴苣[16]等。但该技术也存在一定的缺陷，即所识别的只是潜在过敏原，而不能确定所识别的一定是过敏原。因为利用该技术所识别的蛋白虽然能与过敏患者血清中的IgE结合，但并不是所有能与IgE结合的蛋白都具有致敏性。过敏原除了必须能与过敏患者血清中的IgE结合，还要能与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE受体（FcεRⅠ受体）结合。因此，要想利用过敏组学技术确认所识别的蛋白是否具有致敏性，还需进一步采取口服激发或者皮试来验证。

3.2 定量加工食品中的过敏原含量

非常微量的过敏原也可能引起严重的过敏反应。因此，目前许多国家都要求食品生产厂家在食品包装上标明过敏原成分。由于在食品生产过程中可能存在过敏原交叉污染，加工食品中过敏原种类及含量的检测就变得尤为重要。ELISA是常用检测食物组分中过敏原含量的一种方法，但由于该方法需要使用过敏原特异性的抗体，限制了它的应用。在过敏组学中，通过选择过敏原蛋白的特征肽段进行质谱的多反应监测，也可以对食品中的过敏原进行定性和定量检测。比如Careri等利用LC-ESI-MS/MS技术建立了一种基于检测目标肽来定量食物中花生过敏原的方法[17]。他们首先利用LC-ESI-Q TOF MS/MS技术从花生过敏原Ara h 2和Ara h 3/4中找出四个花生过敏原特征肽，然后利用这四个特征肽及质谱中的选择反应监测技术来筛查食品中的花生过敏原，利用外标法检测了食物样品中花生过敏原的含量，最低检测限可达到1μg/g食品。随后，该技术被分别用于坚果[18-19]、牛奶[20-22]、鸡蛋[23]、大豆[24]和虾[25]等食物中过敏原的定量分析。此外，Heick等利用LC/MS/MS技术建立了一种同时检测焙烤食物中多种过敏原的方法，也获得了成功[26]。他们还以面包为例，分别用该方法和商品化的ELISA试剂盒对焙烤前后面包中的牛奶、鸡蛋、花生、大豆、榛子、核桃和杏仁7类过敏原进行了检测，发现焙烤对不同方法检测出的结果有影响，其中以对面包中牛奶过敏原的检测影响最大。应用过敏组学方法检测加工食品中的牛奶过敏原具有较高的检测灵敏度，而用ELISA方法则检测不到。因为ELISA方法主要是利用其试剂盒中所含的抗体与加工的食品结合来检测的，而食品加工方法可能会破坏或者部分破坏食品中与抗体结合的表位，尤其是构象性表位，导致其与抗体结合的能力下降，因而用ELISA方法检测不出，但这种破坏并不会对质谱分析产生多大影响。此外，在定量加工食品中的过敏原方面，过敏组学方法不会出现像ELISA法中常出现的假阳性和假阴性。由此可见，过敏组学方法在加工食品中痕量过敏原的检测和定量具有明显优势。

3.3 应用过敏组学技术评估新食品的安全性

近年来，随着转基因食品种类的丰富和数量的增加，其安全性也引起了广泛关注。其中转基因食品的致敏性对于过敏患者来说尤为重要。目前人们利用过敏组学方法对转基因食品的致敏性进行了大量的研究。Batista等对转基因大豆的蛋白组进行了研究，并利用2D电泳和免疫印迹技术评估了转基因大豆的致敏性，结果发现大豆过敏患者对转基因大豆和非转基因大豆的识别无差异，但是从转基因大豆中多识别了2种潜在过敏原[27]。Nakamura等对转基因土豆的安全性进行了研究，发现转基因土豆与非转基因土豆在蛋白表达上略有差异，其中转基因土豆表达的过敏原马铃薯糖蛋白前体的量比非转基因土豆稍多，但两者对土豆过敏患者血清中的IgE的识别基本相同[28]。Fonseca等对转基因玉米MON 810的免疫学性质进行了评估，并发现了在转基因和非转基因玉米中均存在14种新的IgE结合蛋白[29]。Thelen团队利用2-D电泳和质谱技术识别出了大豆、油菜、蓖麻和拟南芥四种油料作物的500多个蛋白，并绘制了相应作物的蛋白图谱，这些蛋白图谱可为后续评估转基因作物的安全性提供有效数据[30]。此外，过敏组学技术还常被用于评估经不同加工方法制作的新食品的安全性，如用面筋蛋白澄清后的红酒[31]、焙烤的曲奇[18]以及经高压、焙烤等处理的坚果等[32-37]，这样的应用研究很多，在此不一一赘述。

4 展望

过敏组学虽然是新近提出的一项组学，但其作为蛋白质组学的一部分，其研究方法已日趋成熟，未来将会有更广泛的应用，如在食物过敏原的定性和定量方面，可开发更简单、更精确地定性和定量食物过敏原的方法。此外，可考虑将过敏组学技术与其他技术相结合，在过敏原的筛查与诊断方面做出贡献。

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Outlines of study on allergenomics and its application on food allergy

TONG Ping1，HU Yan-lian2，GAO Jin-yan3，LI Xin1，3，YANG An-shu4，WU Zhi-hua1，4，CHEN Hong-bing1，4，*

（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.The People’s Hospital of Yichun City，Yichun 336000，China；3.College of Life Sciences and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 336000，China；4.Sino-German Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

Recently，the number of allergic patients is increasing，and the proteins responsible for allergic reactions have attracted much attention.Therefore，allergenomics was proposed.In this paper，the conception，the research technique and the application of allergenomics on food allergy were briefly reviewed.

allergenomics；allergen；food allergy

TS201.6

A

1002-0306（2014）14-0381-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.075

2013－10－28 *通讯联系人

佟平（1984-），女，助理研究员，研究方向：食品营养与安全。

国家高技术研究发展计划（863计划）（2013AA102205）；国家自然科学基金（31171716，31301524）；高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（20113601110003）；国家国际科技合作专项资助（2013DFG31380）；江西省自然科学基金重点项目（20133ACB2009）；江西省科技计划项目（20122BBG70170-2）。