主要酿造因子对野生酵母β-葡萄糖苷酶产量的影响

王玉霞，张　超（．宜宾学院生命科学与食品工程学院，发酵资源与利用四川省高校重点实验室，生物工程研究所，四川宜宾644000；2．宜宾学院生命科学与食品工程学院，发酵资源与利用四川省高校重点实验室，食品科学与工程研究所，四川宜宾644000）

主要酿造因子对野生酵母β-葡萄糖苷酶产量的影响

王玉霞1，张超2，*
（1．宜宾学院生命科学与食品工程学院，发酵资源与利用四川省高校重点实验室，生物工程研究所，四川宜宾644000；2．宜宾学院生命科学与食品工程学院，发酵资源与利用四川省高校重点实验室，食品科学与工程研究所，四川宜宾644000）

实验考察了典型葡萄酒酿造因子糖、酸、醇对野生酵母β-葡萄糖苷酶产量的影响，以评价菌株在葡萄酒酿造条件下的应用性能。结果表明，各菌株β-葡萄糖苷酶主要定位在胞内，总酶活力以H.uvarum菌株的0.51U/mL为最高，P.fermentans菌株最小。各酿造因子对菌株产β-葡萄糖苷酶产量的影响差异较大。较高初始糖含量和低pH条件对各菌株产酶都有显著地抑制作用，其中P.fermentans菌株受抑制作用最大，在pH3.0条件下受抑制程度达到了63.50%～84.32%，Saccharomyces和Hanseniaspora两属酵母受影响较小，且H.uvarum在酸性条件下的产酶量最高。较低浓度的乙醇（5%）对菌株产酶有一定的促进作用，随着乙醇含量的增加，各菌株产酶量都受到了显著抑制，P.fermentans菌株甚至没有酶的产生。综合各因子对各菌株产酶量的影响情况，H.uvarum菌株以较优表现展示出其较好的应用前景。

野生酵母，β-葡糖苷酶，酿造因子

来自水果等原料的香气物质，以游离态和结合态两种方式存在。游离态香气物质直接呈现出能被感知的气味，而含量较多的无色、无味、不具挥发性结合态的香气多数为糖苷类物质，必须经过水解才能使香气表现出来[1-3]。糖苷类风味物质的水解分为酸水解和酶水解两类。其中作用温和、反应迅速、高效率的酶水解，在生产中倍受青睐[4]。β-D-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）是一类能水解糖链非还原末端糖苷键的一类水解酶。因广泛用于果汁、果酒等结合态风味物质的水解，释放香气成分而被称为风味酶。糖苷类风味物质的水解涉及多种酶的参与，β-葡萄糖苷酶是其中的关键酶[5-6]。

β-葡萄糖苷酶在自然界的分布非常广泛，包括植物、动物、昆虫、丝状真菌、酵母菌、细菌等[1，7]。与植物、动物、昆虫以及细菌相比，酵母细胞所具有的培养、生长特性，使从酵母菌中筛选比活高、特性优良的β-葡萄糖苷酶成为优势。尤其是从酿造环境中筛选能体现区域酒种风格的优良酵母，这个优势就更为明显了[8-9]。

实验通过考察典型葡萄酒酿造因子糖、酸、醇对酵母β-葡萄糖苷酶产量的影响，评价酵母菌株在葡萄酒酿造中的应用潜能，为产β-葡萄糖苷酶酵母菌的生产应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

所用菌株分离自果园土壤，鉴定为Hanseniaspora uvarum、Saccharomyces cerevisiae和Pichia fermentans菌株；酵母粉、蛋白胨、琼脂粉 英国oxoid公司，分析纯；葡萄糖、磷酸氢二钠、柠檬酸、无水乙醇、浓盐酸、氢氧化钠、酒石酸钠、咪唑、GSH、曲通、甲苯、乙醇中国医药集团上海化学试剂公司，分析纯；pNPG（p-nitrophenyl-β-D-glycoside）Sigma-Aldrich，分析纯；其余所有试剂均为分析纯。

HX-9080B-2型生化恒温培养箱上海福码实验设备有限公司；PB2002-N型称量天平、AB204-E型分析天平、320-S型精密pH计Delta瑞士Mettler Toledo公司；SS325型高压蒸汽全自动灭菌锅日本Tomy公司；无菌超净工作台苏州净化设备厂；酶标仪美国Thermo公司；3K型冷冻高速离心机德国Sigma公司。

1.2实验方法

1.2.1β-葡萄糖苷酶活力测定pH5.0 P-C缓冲溶液：称取Na2HPO43.689g、C6H8O71.01g溶于100mL蒸馏水中，调pH至5.0并定容。底物（pNPG）工作液：准确称取150.65mg pNPG，完全溶解于100mL pH5.0的P-C缓冲中备用。

酶活测定：将菌株28℃静置培养3d的发酵液4℃，8000×g离心5min，取5μL上清液与100μL底物pNPG溶液（5mmol/L）混匀，50℃保温30min，加入200μL 1mol/L Na2CO3中止反应并显色，将反应液在400nm下用酶标仪测定吸光值[10]。

酶活力单位定义：在标准检测条件下，每分钟水解产生1μmol的pNP所用的酶量为一个酶活单位[10]。

1.2.2培养基液体YPD（w/v）：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。依据葡萄醪平均pH（3.5～4.0）、葡萄醪平均糖含量（20%）、普通葡萄酒酒度（12%），分别对选择的代表菌株进行不同逆境条件下产酶情况的考察。产酶条件分别选培养初始条件为葡萄糖含量20%（200g/L），pH3.0、4.0、5.0以及5%、10%、15%的乙醇浓度。以5%接种量分别接种各类培养基，28℃，200r/min摇瓶培养，三次重复。每天测定酶产量，连续9d，以考察产酶量的最大时间及各菌株产酶差异情况。对照为2%葡萄糖的普通YPD培养基，pH自然，不加乙醇。在考察20%葡萄糖初始含糖量对菌株产酶情况影响实验中，实验测定酶产量的同时，监控测定培养基pH变化情况。

1.2.3酶在细胞的定位YPD培养基50mL/250mL三角瓶，5%接种量，30℃，200r/min，培养48h。

取1mL细胞培养液8，000×g、4℃条件下离心15min，取上清液并测定酶活（胞外）；收集细胞用无菌水清洗两次、8，000×g、4℃条件下离心10min后，弃去上清液，向沉淀中加入0.2mL P-C缓冲溶液（pH5.0），漩涡振荡均匀，按常规方法测定酶活（细胞膜）。

另取5mL细胞培养液8，000×g、4℃条件下离心15min，收集细胞用无菌水清洗两次、8，000×g、4℃条件下离心10min后，向细胞沉淀中加入1mL咪唑、50μL GSH、10μL曲通、50μL甲苯∶乙醇（1∶4，v/v），漩涡振荡5min，8，000×g、4℃条件下离心5min后收集沉淀，加入5mL无菌冰水摇匀后，取1mL冰水溶液离心并用冰水洗涤数次，收集沉淀，加入0.2mL P-C缓冲溶液（pH5.0），溶液按常规方法测定酶活（细胞内）[11]。所有测定均重复三次。

1.3数据统计

实验数据应用SPSS19.0进行处理分析。

2　结果与分析

2.1酶在细胞的定位

在对各野生菌株产酶情况考察之前，首先分析了不同产酶菌株β-葡萄糖苷酶在细胞中的定位情况。从图1中数据分析在胞内、细胞膜和细胞外β-葡萄糖苷酶活力分布情况，可以得出，所有参试种属菌株的酶都主要定位在细胞内，约占了全部酶活的39.30%～47.35%，其中胞内酶活比例占的最大的是P.fermentans酵母，最低的是S.cerevisiae酵母。S.cerevisiae和H.uvarum酵母胞外酶活比例较大，最小的是P.fermentans酵母，只有21.25%的β-葡萄糖苷酶活在细胞培养上清液中存在。三个菌株定位在细胞膜的β-葡萄糖苷酶差异不是很大，集中在28.45～32.80%这个小范围内。

图1　菌株β-葡萄糖苷酶定位情况Fig.1　Enzyme location of different yeast strains

然而从各菌株总酶活情况可以得出（图2），三个菌株的总酶活H.uvarum最大，达到0.51U/mL，其次是S.cerevisiae菌株（0.43U/mL），最低的是P.fermentans 0.22U/mL，只有最高总酶活力H.uvarum菌株的42.55%。

图2　菌株β-葡萄糖苷酶总酶活Fig.2　Total enzymatic activities from different yeast strains

2.2酿造因子对酶产量的影响

2.2.1200g/L葡萄糖对各菌株产酶的影响从表1数据可以看出，与对照培养基相比，菌株在高糖培养条件下，生长过程中pH都比较低。这是由于高碳氮比培养条件下，微生物代谢过程菌体产酸能力提高，以及菌体在高糖环境下，自身对这种胁迫效应的一种保护机制。

表1　高糖条件下各菌株发酵过程中pH变化情况Table 1　pH change of different strains with high glucose fermentation

表2　高糖条件下各菌株产酶情况比较Table 2　Comparison the enzyme production of different strains under high glucose concentration

表2数据展示了各菌株在高糖和对照培养基中产酶变化情况。三个菌株在高糖条件下的产酶量分别为P.fermentans菌株0.045～0.140U/mL，H.uvarum菌株0.206～1.750U/mL，S.cerevisiae菌株0.100～1.110U/mL，而对照培养基中的产酶量分别为P.fermentans菌株0.137～0.741U/mL，H.uvarum菌株0.415～2.520U/mL，S.cerevisiae菌株0.346～2.443U/mL。与对照相比，高浓度葡萄糖含量对各菌株产β-葡萄糖苷酶能力都表示出了显著的抑制作用。其中受高葡萄糖影响最强的是P.fermentans菌株，与对照培养基相比，高糖条件下产酶量减少了67.15%～81.54%，其次是S.cerevisiae菌株的48.28%～71.10%。H.uvarum在三个菌株中表现最优，在对照和高糖条件下产酶量都显著高于其他菌株，在两种培养条件下的最大产酶量分别为1.75U/mL和2.52U/mL。在测试期间内，高糖初始条件对H.uvarum菌株产酶的抑制作用，除第1d外（50.36%），基本在50%范围以下，远低于P.fermentans和S.cerevisiae菌株。由此可见，在相同培养条件下，H.uvarum菌株显著高于其他菌株，表现出了较强于其他菌株的应用性能。

2.2.2低pH对各菌株产酶的影响由表3可知，分属于三个种的参试菌株的产酶情况，都显著受到低pH的强烈抑制，其中pH3.0对各菌株的产酶量影响最大。与对照相比，在pH3.0条件下，P.fermentans受到的抑制作用达到了63.50%～84.32%，其次是S.cerevisiae菌株的59.76%～82.08%。受抑制程度最小的是H.uvarum菌株，产酶量达到了0.078～0.871U/mL（pH3.0条件下），0.320～1.613U/mL（pH4.0条件下），0.331～1.964U/mL（pH5.0条件下）。随着pH升高，各菌株产酶量显著增加。在相同pH条件下，三个菌株的产酶量差异较大，其中H.uvarum菌株比P.fermentans和S.cerevisiae菌株的产酶量要高，且达到了显著差异水平，三个菌株产酶量从高到低的顺序是H.uvarum菌株、S.cerevisiae菌株、P.fermentans菌株。与其他菌株相比，H.uvarum菌株在低pH条件下较好地产酶特性，显示出此菌较好地在低pH条件下的应用潜能。

表3　不同初始pH条件下各菌株产酶情况Table 3　Production of enzyme with different start pH values

2.2.3乙醇对各菌株产酶的影响从不同浓度乙醇实验结果（见表4）可以得出，低浓度乙醇对各菌株的产酶都有一定程度的促进作用。含有初始浓度5%乙醇的培养条件下，三个菌株的产酶量，在前期基本都有显著地增加，其中P.fermentans菌株在第5d的增幅最大，达到了61.75%，其次是S.cerevisiae菌株第3d的增加量54.10%。随着培养基中乙醇浓度的增加各菌株产酶量都受到了强烈的抑制，其中最强的是P.fermentans菌株，在10%和15%乙醇浓度下，甚至没有β-葡萄糖苷酶的产生，而H.uvarum和S.cerevisiae菌株产酶量都显著低于对照，且10%乙醇浓度对酶产生的抑制程度达到了90%以上。从酶学性质角度分析，高浓度醇对酶蛋白有一定的变性作用，从而导致酶活力的损失。本实验中高浓度乙醇对酶产量的影响，是酶受乙醇的变性失活作用和酵母细胞产酶受抑制两方面的综合影响效果。在一定浓度乙醇存在条件下，H.uvarum菌株产酶量表现显著高于S.cerevisiae菌株的特性，这将在一定程度上赋予其酿造条件下较好的应用前景。

表4　不同醇浓度对各菌株产酶情况的影响Table 4　Production of enzyme from different strains with different ethanol concentrations

3　讨论

综合糖、pH、醇三因子对各菌株产酶情况考察结果，可以得出各酿造因子对菌株的影响程度各不相同。pH实验中，随着pH的降低，所有菌株的产酶量都受到强烈的抑制。醇实验中，在5%醇浓度下，一定时期内，参试菌株的产酶量都高于对照。乙醇虽然是一种胁迫因子，但在一定浓度范围内，也是一种有效提高细胞通透性的试剂，低浓度条件下因为对细胞的伤害作用较小，相反在一定程度上却提高了细胞膜的通透性，使得细胞内物质渗到胞外的量较正常情况有所增加，而表现出胞外发酵上清液中酶量的增加。但随着浓度的升高，表现出对细胞生长、代谢的较强的抑制作用，以致P.fermentans菌株在高浓度乙醇存在条件下，已经检测不到酶的产生[12]。

4　结论

β-葡萄糖苷酶在细胞中的定位情况显示，三个菌株的β-葡萄糖苷酶都主要定位在胞内。总酶活最大的是H.uvarum菌株，达到了0.51U/mL，其次是S.cerevisiae菌株。高糖和低pH对各菌株产酶能力影响各不相同。H.uvarum菌株无论是在高糖还是对照条件下，分别以1.750U/mL和2.520U/mL的产酶量显著高于其他菌株，且在最低pH3.0的条件下产酶量也显著高于其他菌株，充分显示出较强的应用潜能。在发酵前期，较低浓度乙醇（5%）对所有菌株的产酶量都有一定的促进作用，然而随着乙醇浓度的升高，各菌株产酶量迅速下降，甚至没有β-葡萄糖苷酶的产生（P.fermentans）。H.uvarum在对照、高糖以及低pH条件下，产酶量显著高于其他菌株的较好表现，急需在进一步研究中进行考察，从而挖掘其酿造应用潜能。由于酿造因子单因子条件下，菌株产酶情况差异较大，因此需要在后期研究中进一步考察菌株在实际酿造条件下的产酶情况，以全面探索菌株的酿造特性，以及对酿造环境中结合态风味前体的释放情况等。

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Effect of oenological factors on the productions of β-glucosidases from wild yeasts

WANG Yu-xia1，ZHANG Chao2，*
（1.Key Laboratory of Fermentation Resources and Application of Institutes of Higher Learning in Sichuan，School of Life Science and Food Engineering，Institute for Bioengeering，Yibin University，Yibin 644000，China；2.Key Laboratory of Fermentation Resources and Application of Institutes of Higher Learning in Sichuan，School of Life Science and Food Engineering，Institute for Food Science and Engineering，Yibin University，Yibin 644000，China）

The main objective of this study was to investigate the potential applications of wild yeast strains by assaying the enzyme production under simulated oenological conditions.The results indicated that most βglucosidases were intracellular activity.The highest total activity of H.uvarum was detected，0.51U/mL.A remarkable variability in the effects of oenological factors on the production of β-glucosidase were observed among yeast strains.The significant inhibitions on the β-glucosidase productions were observed under high sugar and low pH conditions.The strongest inhibition on P.fermentans was observed，for 63.50%～84.32%inhibition in comparion with control at pH 3.0，followed by Saccharomyces and Hanseniaspora.Furthermore，H.uvarum exhibited highest β-glucosidase production under the low pH conditions.Under the low concentration of alcohol（5%），the productions of yeast β-glucosidase were increased.But the β-glucosidases production decreased with increasing the concentration of alcohol，even no β-glucosidase activity could be detected for P.fermentans strain.In conclusion，the better performances endowed H.uvarum strain some potential application.

wine yeast；β-glucosidase；oenological factors

TS261.4

A

1002-0306（2014）14-0205-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.037

2014－01－06*通讯联系人

王玉霞（1974-），女，博士，讲师，研究方向：酿造工艺与微生物。

四川省教育厅重点项目（13ZA0197）；博士启动项目（2012B17）；发酵与资源利用四川省重点实验室开放基金重点项目（2011KFZ002）。