脉冲强光对糙米发芽过程中内源酶活性的影响

王 勃，惠丽娟，刘 贺，何余堂，蒋 静，刘 昕，马 涛（渤海大学化学化工与食品安全学院，渤海大学粮油科学与技术研究所，辽宁锦州121013）

脉冲强光对糙米发芽过程中内源酶活性的影响

王 勃，惠丽娟，刘 贺，何余堂，蒋 静，刘 昕，马 涛*
（渤海大学化学化工与食品安全学院，渤海大学粮油科学与技术研究所，辽宁锦州121013）

研究了脉冲强光（IPL）不同单次能量、闪照次数、开始处理时间对糙米发芽过程中α-淀粉酶、蛋白酶及谷氨酸脱羧酶（GAD）的影响。结果表明，糙米浸泡后，在单次闪照能量400J，闪照次数300次，发芽25h时，α-淀粉酶活力达到12.38mg（g·min）-1、蛋白酶活力达到102.36mg（g·min）-1、谷氨酸脱羧酶（GAD）活力达到10.83mg（g·min）-1最高值分别为无处理组的2.87、1.30、2.16倍；高强度的脉冲强光处理，会抑制发芽糙米内源酶活性。糙米浸泡后进行适宜的脉冲强光处理，可以提高其内源酶的活性。

脉冲强光，发芽糙米，内源酶活性

糙米发芽是一个复杂的生理生化变化过程，是内源酶被激活和释放的过程，其生化路径和产物形成容易受外界环境变化而改变[1]。糙米发芽初期主要的水解酶是α-淀粉酶，胚乳中的淀粉被α-淀粉酶转化为可代谢的糖，为糙米的根芽生长提供能量。糙米发芽过程中，贮藏的蛋白物质在蛋白酶的作用下分解为多肽及氨基酸，为糙米生长提供氮源，并且在复杂生理生化反应中转化为种子萌发和生长所需的物质。植物中谷氨酸脱羧酶的活性与植物衰老、种子发育和成熟有关。糙米发芽过程中产生的功能因子γ-氨基丁酸（GABA）的含量与GAD的活性有直接关系。在相关酶的作用下，糙米体内蛋白质分解、氨基酸代谢转化生成L-谷氨酸，L-谷氨酸在磷酸吡哆醛等辅酶的作用下，经GAD催化脱羧生成GABA。由于GAD使谷氨酸脱羧产生GABA，因而研究GAD活性对于功能食品的开发意义重大。

研究表明，脉冲强光技术在一定处理条件下可以促进糙米发芽。本文通过研究糙米发芽过程内源酶活性变化与脉冲强光处理条件的相互关系，为通过控制GAD活性变化提高糙米发芽GABA的含量及揭示其机理提供依据[2-3]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

稻米品种“辽星1号” 由中稻股份有限公司提供，实验前用砻谷机去除稻谷外壳获得糙米；GABA标准品（纯度≥99%）、酪蛋白 Sigma公司；次氯酸钠（有效氯为9%） 广东汕头市西陇化工厂；重蒸苯酚（AR） 武汉天源生物技术有限公司；氯化钠、葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸、（NH4）2SO4、可溶性淀粉、苯甲基磺酰氟 国药集团化学试剂有限公司；磷酸吡哆醛、乙二胺四乙酸 南京赛吉生化试剂公司；β-巯基乙醇、酪氨酸、牛血清蛋白 上海申鹤化学有限公司。

LA50-800H脉冲强光表面杀菌实验柜 宁波中物光电杀菌技术有限公司；电子天平BT1245 北京赛多利斯仪器有限公司；HH.B11-500电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；HH-601A超级恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂；UV1200型紫外可见分光光度计 上海正慧工贸有限公司；PB-20标准pH计 北京赛多利斯仪器系统有限公司；冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 发芽糙米的制备 工艺流程：稻谷→砻谷→筛选→手工精选→清洗→杀菌→清洗→浸泡→发芽→清洗→干燥→成品[4]。

将精选的糙米30℃条件下浸泡12h，然后进行发芽糙米的培养，期间进行相应脉冲强光照射处理。为抑制糙米发芽过程中微生物的污染，将糙米用1.0%的次氯酸钠溶液浸泡5min，蒸馏水冲洗3遍后，加入4倍体积的水，然后放入恒温水浴锅中浸泡。糙米浸泡后用蒸馏水清洗，均匀地摊于底部铺有四层纱布的培养皿中，然后盖上两层湿润纱布，在30℃恒温培养箱中培养25h发芽。发芽过程每隔2h喷洒去离子水，以保证整个发芽过程的湿润状态。

1.2.2 脉冲强光参数设置与实验方法 脉冲强光装置：工作电压2800V，额定功率1kW，电源：AC220± 10%，内置石英板调节照射距离，共有六个高度可以调节。样品辐照室规格：480mm（宽）×400mm（高）× 270mm（深）。处理样品置于灯管正下方石英板上[5-9]。

在糙米发芽培养不同时间，将单层糙米（均匀铺满培养皿，一般8g/皿），在不同单次能量（300、400、500J）和不同闪照次数（100、200、300、400、500次）下闪照处理，闪照频次为1次/s，处理后，继续培养糙米发芽。处理期间，适当翻动糙米，使其照射均匀。培养25h后，进行相关指标的测定[10-11]。

1.3 α-淀粉酶活力的测定方法

1.3.1 酶液的提取 称取2.00g发芽糙米，加入低温贮藏的pH5.7磷酸缓冲液5mL，匀浆后加入蒸馏水10mL提取，提取液冷冻离心15min，上清液即为淀粉酶提取液。将酶粗提液在70℃加热15min，除去不耐热的β-淀粉酶及其他酶蛋白，而后加入（NH4）2SO4固体进行盐析，4000r/min离心10min，沉淀中加入一定体积的磷酸缓冲液（pH5.7），使其溶解，取上清液进行酶活测定[12]。

1.3.2 酶活的测定 参考朱广廉[13]测定方法，酶活测定时，试管先加入2mL的磷酸缓冲液和0.5mL 1%可溶性淀粉溶液，酶液及试管均在40℃条件预保温10min，之后将0.5mL酶液加入试管中，准确反应5min，加入6mol/L NaOH 1mL终止反应，加入2mL DNS试剂并摇匀，沸水浴5min，流水冷却，用水稀释至25mL。将试管摇匀，显色后测定吸光度。通过葡萄糖标准曲线Y=1.550X+0.0292（Y为葡萄糖的浓度，mg/mL；X为A540，R2=0.999）计算α-淀粉酶产生的葡萄糖含量。

1.4 蛋白酶活力测定方法

1.4.1 酶液的提取 称取2.00g发芽糙米，于研钵中加入8mL磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲（pH6.0，0.1mol/L），冰浴下研磨成匀浆。之后在4℃下10000r/min离心30min，取上清液进行酶活力测定。

1.4.2 酶活的测定 参考Harvey BMR[14]测定方法，以酪蛋白溶液（20g/L）为底物，1mL的底物溶液和1mL的酶提取液在40℃下保温10min，之后90℃水浴保温5min灭酶，然后加入2mL TCA（0.4mol/L）溶液于室温下沉淀未反应的蛋白质15min。蛋白酶活力通过测定在275nm处吸光值的增加量计算，对照管与上述所加组分相同，但在进行反应前先加入TCA溶液灭酶。以酪氨酸作为标准，测定中1g发芽糙米的酶提取液每分钟产生1μg酪氨酸定义为1U的蛋白酶活力。

1.5 谷氨酸脱羧酶活性的测定

1.5.1 酶液的提取 取5.00g发芽糙米用提取缓冲液[50mmol/L磷酸缓冲液（pH5.7），0.2mmol/L磷酸吡哆醛（PLP），2mmol/L EDTA，0.2%β-巯基乙醇，0.15mmol/L氯化钠]研磨匀浆定容到50mL，静止提取2h后于4000r/min离心10min，取上清液进行酶活测定[15]。

1.5.2 酶活的测定 取0.3mL粗酶液加入0.2mL的底物反应液[含50mmol/L磷酸缓冲液（pH5.7），0.2mmol/L磷酸吡哆醛，100mmol/L L-谷氨酸]，于30℃水浴保温30～180min后迅速置于冰浴中终止反应，测定产生的GABA含量，以1g发芽糙米酶提取液每分钟催化L-谷氨酸脱羧生成1μg GABA为一个酶活力单位（U）。

2 结果与分析

2.1 脉冲强光处理对糙米α-淀粉酶活性的影响

2.1.1 脉冲强光不同能量在工艺流程不同工序点处理对α-淀粉酶活性的影响 将精选的糙米分别在浸泡前、浸泡后、发芽12h时，采用不同单次能量（300、400、500J）的脉冲强光闪照300次处理。发芽25h后，α-淀粉酶活性见图1。

图1 脉冲强光不同能量在工艺流程不同工序点处理对α-淀粉酶活性的影响Fig.1 Pulsed light of different energy in different process procedures treatment effect on α-amylase activity

由图1可以看出，在不同工序点对糙米进行脉冲强光闪照处理，对α-淀粉酶活性影响不同。浸泡前对糙米进行脉冲强光处理，对糙米α-淀粉酶活性影响不大；浸泡后对糙米进行脉冲强光处理能显著提高酶活性；发芽12h时处理酶活提高程度没有浸泡后好。因此，选择浸泡后实施脉冲强光处理最佳。

2.1.2 脉冲强光不同单次能量对α-淀粉酶活变化的影响 糙米浸泡后进行相应的脉冲强光处理，测定不同时段α-淀粉酶活的变化，不同单次能量α-淀粉酶活性的变化规律如图2～图4所示。

图2 单次能量300J闪照处理对α-淀粉酶活性的影响Fig.2 Effect of single energy 300J on α-amylase activity

单次能量300J不同闪照次数处理条件下，随着发芽过程的进行，α-淀粉酶活性均呈上升趋势，且最终酶活均高于对照组。闪照300次时，α-淀粉酶活性在发芽10h时之前低于400次和500次，但在10～15h时，酶活呈明显升高趋势，随后在15～25h时酶活均高于其他闪照次数，并在25h时达到最高的11.39mg（g·min）-1。说明在300次条件处理下，糙米中α-淀粉酶活性有一个促发点，能使酶活显著提高。

图3 单次能量400J闪照处理对α-淀粉酶活性的影响Fig.3 Effect of single energy 400J on α-amylase activity

单次能量400J不同闪照次数处理条件下，随着发芽过程的进行，α-淀粉酶活性均呈上升趋势，且最终酶活均高于对照组。闪照100、200、300次处理，α-淀粉酶活变化呈上升趋势，闪照400、500次处理，α-淀粉酶活力并没有继续上高，反而低于200次处理，说明增加闪照次数并不能持续提高酶活力，反而有可能抑制酶活力；在单次能量400J，闪照次数300次条件处理下，α-淀粉酶活力在发芽25h时达到了最大的12.38mg（g·min）-1，是无处理组4.32mg（g·min）-1的2.87倍。

单次能量500J不同闪照次数处理条件下，随着发芽过程的进行，α-淀粉酶活性均呈上升趋势，在200次，发芽25h时α-淀粉酶活力达到最高的10.96mg（g·min）-1，但最高酶活力均低于300J和400J，说明增加单次闪照能量不能持续提高α-淀粉酶活力。在发芽时间10～15h时，酶活力变化很小，15h之后酶活力才有明显升高。说明高能量多次数的脉冲闪照处理会延迟α-淀粉酶活的提高，并影响最终α-淀粉酶活。

图4 单次能量500J闪照处理对α-淀粉酶活性的影响Fig.4 Effect of single energy 500J on α-amylase activity

2.2 脉冲强光处理对发芽糙米蛋白酶活性的影响

2.2.1 脉冲强光不同能量在工艺流程不同工序点处理对蛋白酶的影响 将精选的糙米分别在浸泡前、浸泡后、发芽12h时，采用不同单次能量（300、400、500J）的脉冲强光闪照300次处理。发芽25h后，蛋白酶活性见图5。

图5 脉冲强光不同能量在工艺流程不同工序点处理对蛋白酶的影响Fig.5 Pulsed light of different energy in different process procedures treatment effect on protease activity

由图5可以看出，浸泡前对糙米进行脉冲强光处理，对糙米蛋白酶活性影响不大；浸泡后对糙米进行脉冲强光处理，300、400J时蛋白酶活力呈上升趋势，在500J时蛋白酶活力有所下降，高强度脉冲强光会抑制糙米发芽过程中蛋白酶活性；发芽12h时，采用脉冲强光处理处理，在300J时略高于未处理组，400、500J时酶活力均低于未处理组，发芽12h后，糙米发芽过程中蛋白酶活性已经被激活，此时进行脉冲强光处理对蛋白酶活力有抑制作用。因此，选择浸泡后实施脉冲强光处理最佳。

2.2.2 脉冲强光不同单次能量对蛋白酶活变化的影响 糙米浸泡后进行相应的脉冲强光处理，测定不同时段蛋白酶活的变化，“CK”为对照组，不同单次能量蛋白酶活性的变化规律如图6～图8所示。

图6 单次能量300J闪照处理对蛋白酶活性的影响Fig.6 Effect of flash number 300J on protease activity

单次能量300J不同闪照次数处理条件下，随着发芽过程的进行，蛋白酶活性均呈上升趋势，且最终酶活均高于对照组。不同闪照次数对酶活变化趋势影响相似，均是在15～25h酶活显著增高。闪照300次，在发芽25h时，蛋白酶活力最高。

图7 单次能量400J闪照处理对蛋白酶活性的影响Fig.7 Effect of flash number 400J on protease activity

单次能量400J不同闪照次数处理条件下，随着发芽过程的进行，蛋白酶活性均呈上升趋势，且变化趋势大致相同。闪照300次处理时，蛋白酶活最高；闪照500次处理时，蛋白酶活最低且低于对照组。

图8 单次能量500J闪照处理对α-淀粉酶活性的影响Fig.8 Effect of flash number 500J on protease activity

单次能量500J不同闪照次数处理条件下，随着发芽过程的进行，蛋白酶活性均呈上升趋势，与对照组相比，闪照400、500次时，蛋白酶最终酶活低于对照组。说明高能量高次数的脉冲闪照处理会抑制发芽糙米蛋白酶活性。

2.3 脉冲强光处理对发芽糙米谷氨酸脱羧酶（GAD）活性的影响

2.3.1 脉冲强光不同能量在工艺流程不同工序点处理对谷氨酸脱羧酶的影响 将精选的糙米分别在浸泡前、浸泡后、发芽12h时，采用不同单次能量（300、400、500J）的脉冲强光闪照300次处理。发芽25h后，谷氨酸脱羧酶活性见图9。

图9 脉冲强光不同能量在工艺流程不同工序点处理对谷氨酸脱羧酶的影响Fig.9 Pulsed light of different energy in different process procedures treatment effect on glutamic acid decarboxylase（GAD）activity

由图9可以看出，不同时间对糙米进行脉冲强光闪照处理，均能提高GAD活性，但影响程度不同，影响程度依次为浸泡后＞发芽12h＞浸泡前。因此，选择浸泡后实施脉冲强光处理最佳。

2.3.2 脉冲强光不同单次能量对谷氨酸脱羧酶活变化的影响 糙米浸泡后进行相应的脉冲强光处理，测定不同时段谷氨酸脱羧酶活的变化，“CK”为对照组，不同单次能量谷氨酸脱羧酶活性的变化规律如图10～图12所示。

图10 单次能量300J闪照处理对谷氨酸脱羧酶活性的影响Fig.10 Effect of single energy 300J on GAD activity

单次能量300J不同闪照次数处理条件下，随着发芽过程的进行，GAD活性均呈上升趋势，且最终酶活均高于对照组。不同闪照次数对GAD活性变化趋势影响相似，均是在10h后开始显著增高。闪照300次，GAD活性最高。

单次能量400J不同闪照次数处理条件下，随着发芽过程的进行，GAD活性均呈上升趋势。闪照300次处理时，GAD活性最高，酶活变化呈直线上升；闪照500次处理时，GAD受到抑制。

单次能量500J不同闪照次数处理条件下，随着发芽过程的进行，谷氨酸脱羧酶活性均呈上升趋势，闪照500次处理，上升趋势不明显。与对照组相比，闪照400、500次时，谷氨酸脱羧酶最终酶活低于对照组。说明高能量高次数的脉冲闪照处理会降低发芽糙米GAD活性。

图11 单次能量400J闪照处理对谷氨酸脱羧酶活性的影响Fig.11 Effect of single energy 400J on GAD activity

图12 单次能量500J闪照处理对谷氨酸脱羧酶活性的影响Fig.12 Effect of single energy 500J on GAD activity

3 结论

3.1 单次能量高于300J，会抑制发芽糙米内源酶活性。糙米浸泡后进行适宜的脉冲强光处理，可以提高其内源酶的活性。不同工序利用脉冲强光处理对发芽糙米酶活影响依次为：浸泡后＞发芽12h＞浸泡前。

3.2 对α-淀粉酶的影响：单次能量400J，闪照300次，发芽25h时，α-淀粉酶活力达到12.38mg（g·min）-1，酶活是无处理组的2.87倍。

3.3 对蛋白酶的影响：单次能量400J，闪照300次，发芽25h，蛋白酶活性达到最大值，蛋白酶活力达到102.36mg（g·min）-1，是无处理组1.3倍。

3.4 对谷氨酸脱羧酶的影响：单次能量400J，闪照300次，发芽25h，GAD活性达到最大值10.83mg（g·min）-1，是无处理组的2.16倍。

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Effect of pulsed light treatment on the endogenous enzyme activity of germinated brown rice

WANG Bo，HUI Li-juan，LIU He，HE Yu-tang，JIANG Jing，LIU Xin，MA Tao*
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Jinzhou 121013，China）

The effects of pulsed light through different single energy，flash time and treatment start time on the activity of alpha-amylase，protease，and glutamic acid decarboxylase（GAD）during the brown rice germination was studied.The results showed that brown rice after soaking，single energy of 400J，flash time of 300，the germination of 25h，α-amylase activity reached 12.38mg（g·min）-1，protease activity reached 102.36mg（g·min）-1，glutamic acid decarboxylase（GAD）activity reached 10.83mg（g·min）-1，the maximum value were 2.87，1.30，2.16 times higher than non-treated group.High-intensity pulsed light treatment can inhibit endogenous enzyme activity of germinated brown rice.Suitable pulsed light for processing brown rice after soaking them can improve the endogenous enzyme activity.

pulsed light；germinated brown rice；endogenous enzyme activity

TS210.1

A

1002-0306（2014）14-0118-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.017

2013－10－23 *通讯联系人

王勃（1986-），男，硕士研究生，研究方向：粮油科学。

科技部国家农业成果转化资金（2010GB2B000083）；辽宁省科技攻关课题（2011205001）。