牧区牦牛“曲拉”优质发酵剂的研究

王琳琳，王 军，韩 玲，*，文鹏程，丁考仁青（.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；.甘南州畜牧科学研究所，甘肃合作747000）

牧区牦牛“曲拉”优质发酵剂的研究

王琳琳1，王 军1，韩 玲1，*，文鹏程1，丁考仁青2
（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.甘南州畜牧科学研究所，甘肃合作747000）

以脱脂牦牛乳为研究对象，滴定酸度为考察指标，利用3株具有较强发酵能力的乳酸菌：保加利亚乳杆菌（MGD1-3）、嗜热链球菌（MGB39-5）和植物乳杆菌（BM5152）为因子，研究并筛选3株菌在脱脂牦牛乳中的最佳接种量。在单因素实验的基础上，采用响应面中心旋转组合实验对影响牦牛“曲拉”发酵效果的3个因子进行了优化，建立并分析了各因子与响应值的数学模型。结果表明：在42℃条件下发酵3.5h，3个因素对发酵牦牛乳滴定酸度的影响大小依次为：MGD1-3＞MGB39-5＞BM5152；3株菌MGD1-3、MGB39-5、BM5152最佳组合的接种量为：5.29、7.18、6.30lgcfu/mL，在此条件下制作牦牛“曲拉”，其发酵滴定酸度为71.90°T。接种等量优化组合发酵剂与牧区含菌乳清液于脱脂牦牛乳中进行验证实验，其发酵时间极显著的缩短了8.7h（p＜0.01）、滴定酸度显著的提高了3.97°T（p＜0.05）、活菌数极显著的增加了7.9×107cfu/mL（p＜0.01）。

曲拉，乳酸菌，优质发酵剂，响应面设计

牦牛“曲拉”是牧民将牦牛乳脱脂后，在自然条件下发酵使酪蛋白凝固，风干而制成的粗奶酪，是干酪素生产的主要原料之一[1]。在中国乃至世界上只有甘青川三省交界的青藏高原牧民有将牦牛乳制成“曲拉”的生活习惯，是中国独有的资源[2-3]。到目前为止，牧区主要还是沿用传统粗放式发酵工艺制作“曲拉”，其发酵菌种杂、温度低、无统一接种量以及干燥方式开放等缺点，导致制作“曲拉”存在氧化酸败严重、褐变发暗、杂质含量高等影响品质的问题。“曲拉”品质的优劣与制作工艺各个环节密切相关，尤其在发酵阶段，菌种纯度、发酵性能以及接种量决定其发酵酸度、发酵快慢以及酪蛋白是否沉淀完全[4-6]。因此，优质“曲拉”发酵剂的研究，对品质良好“曲拉”的生产制作有重要意义。而在近年来的相关研究中，秦虹等[7]研究了牧区酸奶优质发酵剂对酸奶品质的影响，Lin等[8]也研究了发酵剂菌种不同配比与纯度对酸奶品质的影响，共同指出菌种纯度越高，酸奶发酵效果越好。Larsson等[9]和Oliveiraa等[10]研究发现发酵剂产酸过快，会使发酵乳质地粗糙、黏度降低并析出大量的乳清，且在贮藏过程中活菌数下降、后酸化增强，从而影响发酵乳的货架期。若发酵剂产酸过慢，会使发酵乳的发酵时间延长，产酸不足，导致发酵乳的品质变差。Cakmakci等[11]研究了发酵效果对贮藏期影响，并指出发酵速度越慢导致乳脂肪氧化越严重，进而明显缩短产品货架期。虽然，国内外关于牧区酸奶发酵剂的研究很多，然而，关于牦牛“曲拉”发酵剂菌种种类、纯度以及发酵效果的研究与报道相对不足。

因此，本研究以脱脂牦牛乳为研究对象，滴定酸度为考察指标，利用3株筛自牧区的乳酸菌：保加利亚乳杆菌（MGD1-3）、嗜热链球菌（MGB39-5）和植物乳杆菌（BM5152）为因子，在单因素实验的基础上，采用响应面中心旋转组合实验对影响牦牛“曲拉”发酵效果的3个因子进行了优化，建立并分析了各因子与响应值的数学模型。从而得出3株菌最佳接种量参数，为牧区优质“曲拉”生产提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

MGD1-3（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、MGB39-5（Streptococcus thermophilus）、BM5152（Lactobacillus plantarum） 均由内蒙古农业大学实验室筛选；脱脂牦牛乳（脂肪1.03%、蛋白质5.22%、干物质17.28%、乳糖3.2%） 采自甘南牧区，现场采用电动式奶油分离机进行脱脂并进行巴氏杀菌，装罐后置于含冰低温采样箱带回实验室，-4℃冷藏备用；发酵乳清液 采自甘南牧区，经自然发酵所得，装罐后置于含冰低温采样箱带回实验室，-4℃冷藏备用；MRS培养基（用于杆菌） 细菌蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏粉5.0g、D-葡萄糖20.0g、Tween-80 1.0g、K2HPO42.0g、醋酸钠5.0g、柠檬酸三钠水合物2.0g、MgSO4·7H2O 200mg、MnSO4·5H2O 54.0mg、蒸馏水1000mL（pH6.5）；M17培养基（用于球菌） 胰蛋白胨5.0g、大豆蛋白冻5.0g、牛肉膏5.0g、酵母膏2.5g、VC0.5g、硫酸镁0.25g、β-甘油磷酸钠5.0g，配成478mL（pH6.7～7.1）。

SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；YX280A型手提式压力蒸汽灭菌器 上海医用核子仪器厂；HG3034A型电热培养箱 南京飞腾实验仪器有限公司；PHS-3C型pH计 上海虹益仪器仪表有限公司；BSA224S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；L500型台式低速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化与传代 开启乳酸菌干粉安瓿管，加入适量生理盐水，溶解混匀，吸取500μL菌液，分别接种于5mL MRS和M17的液体培养基试管中，在37℃条件下恒温培养24h。在相同培养条件下传代2～3次，直至菌体达到对数生长期，然后进行革兰氏染色与活菌数测定。

1.2.2 滴定酸度测定 根据GB/T 5413.34-2010方法进行测定。

1.2.3 活菌数测定 根据GB 4789.2-2010方法进行测定。

1.3 单因素实验

乳酸菌MGD1-3、MGB39-5、BM5152均以3、4、5、6、7、8lgcfu/mL浓度接种于灭菌脱脂牦牛乳中，42℃条件下发酵3.5h，测定其滴定酸度与活菌数[12]。

1.4 乳酸菌不同接种量对滴定酸度参数的优化

在单因素实验的基础上，选取MGD1-3、MGB39-5和BM5152作为多因素交叉组合实验的考察因素，以42℃条件下发酵3.5h的滴定酸度为响应值，采用响应面中心旋转组合方式对乳酸菌不同接种量影响牦牛乳滴定酸度参数进行优化，共设计实验20组，每组做3个平行，利用Design-Expert 8.05b软件对实验数据进行分析处理，以获得最佳参数。每一个自变量的低、中、高实验水平分别以-1、0、+1进行编码。实验因素水平编码表见表1。

表1 实验因素水平编码表Table 1 Test factor levels and coding

1.5 验证实验

将最优复配组合（实验组）与采自牧区含菌乳清液（作对照）以同样的接种量分别接种于灭菌脱脂牦牛乳中，42℃培养，观察直至酪蛋白完全沉淀，分别记录发酵完全所需时间并测定发酵乳清液的滴定酸度及乳酸菌活菌数[12]，每组实验重复3次，取平均值。

1.6 数据处理

所有测定数据，采用Microsoft 2007 Excel整理数据，SPSS 19.0和Design Expert 8.05b进行数据处理及分析。

图1 MGD1-3不同接种量对滴定酸度的影响Fig.1 The effect of different MGD1-3 inoculation quantity on titratable acidity

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 MGD1-3不同接种量对滴定酸度的影响 由图1可知，随着MGD1-3接种量的增加，牦牛乳滴定酸度呈上升趋势，接种量达到5lgcfu/mL时接种量的增加对滴定酸度的影响显著减小（p＜0.05），滴定酸度接近最大值，继续增大接种量会造成菌种浪费，但对发酵酸度的贡献不大，因此，选择较合理MGD1-3的接种量为5lgcfu/mL附近。

2.1.2 MGB39-5不同接种量对滴定酸度的影响 如图2所示，随着MGB39-5接种量的增加，牦牛乳滴定酸度总体呈上升趋势，但当接种量在4～6lgcfu/mL范围时，滴定酸度基本呈直线上升，当接种量达到7lgcfu/mL后滴定酸度增加不再显著（p＞0.05），因此，选择较合理MGB39-5的接种量为7lgcfu/mL附近。

图2 MGB39-5不同接种量对滴定酸度的影响Fig.2 The effect of different MGB39-5 inoculation quantity on titratable acidity

2.1.3 BM5152不同接种量对滴定酸度的影响 如图3可知，随着BM5152接种量的增加，牦牛乳滴定酸度呈升高趋势，当接种量达到6lgcfu/mL后其滴定酸度增加趋于缓和，且不具有显著性（p＞0.05），继续增加接种量，对发酵效果影响较小，并且会造成菌种浪费和成本的增加，因此，较佳BM5152的接种量为6lgcfu/mL附近。

图3 BM5152不同接种量对滴定酸度的影响Fig.3 The effect of different BM5152 inoculation quantity on titratable acidity

2.2 响应面分析法对滴定酸度参数的优化

对MGD1-3（X1）、MGB39-5（X2）、BM5152（X3）进行了3因素3水平响应面分析，3株菌对脱脂牦牛乳发酵滴定酸度的影响三因素二次回归旋转组合实验设计方案及结果见表2和表3。

表2 响应面分析实验设计方案及结果Table 2 Arrangement of central composite design and corresponding test values of yak meat-tenderization by the papain

表3 回归模型方差分析及其系数的显著性检验Table 3 Regression model analysis of variance and coefficient of significance test

利用Design-Expert 8.05b对表2的实验数据进行方差分析、参数估计及显著性检验，具体结果分析见表3，得到滴定酸度与3株菌MGD1-3、MGB39-5、 BM5152接种量的标准三元二次回归方程为：

Y=71.41495+1.71774X1+1.06639X2+0.90031X3-0.31250X1X2+0.58750X1X3+0.16250X2X3-3.12056X12-2.78468X22-1.81214X32。

由方差分析可以看出，回归模型F＝43.33，p＜0.01，说明响应面回归达到极显著；失拟项p＝0.2729＞0.05，因此，失拟检验不显著，说明模型所拟合的二次回归方程与实际相符合，能正确反映滴定酸度Y与X1、X2和X3之间的关系，回归模型可以较好地对优化实验中的各种实验结果进行预测[13-14]。显著性检验结果表明，3株菌MGD1-3、MGB39-5、BM5152的接种量对滴定酸度均有极显著影响（p＜0.01），决定系数R2为0.9750，说明模型的拟合度较好，滴定酸度的实际值与预测值之间具有较好的拟合相关性。方差分析结果表明，各因素对发酵牦牛乳滴定酸度的影响大小顺序依次为：MGD1-3＞MGB39-5＞BM5152。

对3株菌MGD1-3、MGB39-5、BM5152的接种量3个因素，两两交互作用分析，得到交互因子的响应曲面图，见图4。在等高线区域中心，滴定酸度最高，由中心向边缘逐渐减小。若底部投影为椭圆形，则两因素交互作用显著，由此可知MGD1-3与MGB39-5、MGD1-3与BM5152、MGB39-5与BM5152之间的交互作用均不具有显著性（p＞0.05）。

图4 交互因子的响应曲面和等高线Fig.4 Interaction factor of response surface and contour

通过回归方程对各因素求导，得出3株菌MGD1-3、MGB39-5、BM5152对脱脂牦牛乳发酵滴定酸度的最佳接种量参数为：5.29、7.18、6.30lgcfu/mL，在该组合条件下，得滴定酸度的理论值为71.90°T。

2.3 验证实验

接种等量最优组合发酵剂（实验组）与牧区传统含菌乳清液（对照组）验证实验结果如表4所示。表明该优化组合发酵剂发酵性能良好，其发酵时间极显著的缩短了8.7h（p＜0.01）、滴定酸度显著的提高了3.97°T（p＜0.05）、活菌数极显著的增加了7.9×107cfu/mL（p＜0.01）。

表4 验证实验结果Fig.4 The result of verification test

3 结论

3.1 通过3株菌不同接种量进行单因素实验，并进行接种量与滴定酸度之间的显著性分析，以及从经济成本等方面综合考虑，最终选出3株菌MGD1-3、MGB39-5、BM5152的最佳接种量分别在5、7、6lgcfu/mL附近。

3.2 通过响应面设计与分析，得出3株菌对滴定酸度的影响大小依次为：MGD1-3＞MGB39-5＞BM5152。最佳接种量为：5.29、7.18、6.30lgcfu/mL，在该组合条件下，得滴定酸度的理论值为71.90°T。

3.3 由验证实验得到优化组合的发酵剂比牧区含菌乳清发酵时间极显著的缩短了8.7h（p＜0.01）、滴定酸度显著的提高了3.97°T（p＜0.05）、活菌数极显著的增加了7.9×107cfu/mL（p＜0.01）。

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表5 钠替代及预乳化豆油对乳化肠感官评定的影响Table 5 Effect of sodium substituting and pre-emulsifying oil on sensory evaluation of emulsion-type sausages

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Research of high-quality fermentation starter of yak“Qula”in pastoral areas

WANG Lin-lin1，WANG Jun1，HAN Ling1，*，WEN Peng-cheng1，DINGKAO Ren-qing2
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Gan nan Institute of Animal Science and Veterinary，Hezuo 747000，China）

Skim yak milk as the research material，titratable acidity as review indicator，with three strong fermentability lactic acid bacteria including Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus（MGD1-3），Streptococcus thermophilus（MGB39-5），Lactobacillus plantarum（BM5152）were researched and selected the best inoculation amount in skim yak milk.Three parameters were optimized by response surface central rotating composite design for process optimization.Finally，the mathematical model of each parameter was set up and these response values were analysed.The result showed that the influencing factors on titratable acidity of skim yak milk were MGD1-3＞MGB39-5＞BM5152 at 42℃and fermentation lasted for 3.5h.The best inoculation amount of MGD1-3，MGB39-5，BM5152 was 5.29，7.18，6.30lgcfu/mL respectively，and the titratable acidity was 71.90°T. Inoculated equal optimized combination starter and bacteria-containing whey liquid from pastoral areas to verify test，the result showed that the fermentation time significantly was decreased to 8.7h（p＜0.01），titratable acidity went up to 3.97°T（p＜0.05）and the viable count significantly was increased to 7.9×107cfu/mL（p＜0.01）.

Qula；lactobacillus；high-quality fermentation agent；corresponding surface design

TS201.3

A

1002-0306（2014）12-0152-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.024

2013－10－08 *通讯联系人

王琳琳（1988-），女，硕士研究生，研究方向：畜产品加工及贮藏。

公益性行业（农业）科研专项经费项目（201303085）。