三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

舒 畅，姜琛璐，钟慈平，李 林（西南大学食品科学学院，重庆400715）

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

舒 畅，姜琛璐，钟慈平，李 林*
（西南大学食品科学学院，重庆400715）

目的：建立同时快速检测沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法：根据沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因及肠出血性大肠杆菌O157∶H7的uidA基因设计3对引物，通过单因素实验、L9（34）正交实验优化反应体系，并对多重PCR扩增的敏感性进行分析。结果：3对引物能特异性扩增出495、620、252bp的目的片段；在最优多重PCR反应体系下，多重PCR检测3种致病菌的灵敏度达104CFU/mL；将该法应用于人工污染实验，可在5h内得到准确、稳定的检测结果。结论：该方法操作简单、检测特异性和灵敏度较高，能够实现对沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7 3种食源性致病菌的快速监控和诊断。

食源性致病菌，多重PCR，沙门氏菌，志贺氏菌，肠出血性大肠杆菌O157∶H7

食品安全是当前世界公共卫生问题的焦点，近年来，食品安全事件频繁发生，其中食源性疾病以其高发病率成为食品安全面临的最突出问题。据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年的食源性疾病病例多达数十亿例，其中有220万人因此而丧生[1]。引起食源性疾病的首要危害因子是食源性致病菌，其来源多样、繁殖迅速[2]，常见的有沙门氏菌（Salmonella）、志贺氏菌（Shigella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、单增李斯特菌（Listeria Monocytogens）等[3]。目前，对食源性致病菌的检测多采用常规培养法、免疫法等[4]，程序繁琐，耗时费力，难以满足公共卫生事件应急处理快速、准确的需要。随着分子生物学的发展，尤其是PCR技术的诞生，针对如沙门氏菌[5]、金黄色葡萄球菌[6]、志贺氏菌[7]、单增李斯特菌[8]等某一种菌或某一类致病菌的PCR方法得以建立，弥补了传统培养方法的不足，提高了检测效率及准确性。然而，在食品工业高速发展的今天，食品的污染情况更为复杂，污染致病菌的不确定性及多样性使检测工作的难度加大，容易误检或漏检[9-10]，因此，建立一种高效、灵敏、特异性强的检测方法迫在眉睫。多重PCR技术为此提供了可能，它可实现在一个反应体系中，使用多对特异性引物，完成对多种病原微生物的同时检测或鉴定[11]，具有快速、经济、简便的特点，是未来食源性致病菌检测技术的主要发展趋势[12]。

沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌是三种常见的食源性致病菌，均属肠杆菌科，其形态和生理特性较相似，容易交叉污染，引起食物中毒[13]。采用多重PCR技术同时对该三种菌进行检测具有较大的实用价值，然而，国内外在这方面的研究成果较少。本研究通过引物设计、单因素、正交实验确定了方法，并通过特异性和灵敏度实验对该方法进行了效果验证，并分析了实验中出现的问题及解决方案，以期为快速检测食源性致病菌、有效控制病原菌传播、预防食物中毒、减少疾病发生提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株编号、名称及来源 见表1；细菌基因组DNA提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒天根生化科技（北京）有限公司；10×PCR Buffer（Mg2+free）、MgCl2（25mmol/L）、dNTP Mixture（2.5mmol/L each）、rTaq DNA polymerase（5U/μL）、6×DNA loading Buffer、100bp DNA ladder、DL1000 DNA Marker 宝生物工程（大连）有限公司；沙门氏菌、志贺菌属琼脂平板（ss琼脂）、麦康凯琼脂平板 重庆庞统医疗器械有限公司；O157显色培养基 郑州博赛技术股份有限公司；脑心浸液肉汤 英国OXOID公司。

PTC-200核酸扩增仪 美国MJ公司；DYY-11电泳仪 北京市六一仪器厂；ChemiDoc XRS凝胶成像仪 美国伯乐公司；eppendorf离心机 德国eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据三种食源性致病菌的特异性保守序列[14-16]，即沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因和肠出血性大肠杆菌的uidA基因，利用软件Oligo6.0、Primer5.0[17]设计引物，引物序列见表2，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 菌株及其来源Table 1 Strains in this study

表2 多重PCR引物序列Table 2 Primers for multiplex PCR

1.2.2 细菌培养及模板DNA的制备 将沙门氏菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157∶H7分别接种于脑心浸液肉汤中，36℃过夜培养，采用细菌基因组DNA提取试剂盒制备模板DNA，产物于-20℃保存备用。

1.2.3 单重PCR反应

1.2.3.1 单重PCR体系的建立及引物特异性验证 分别以3株沙门氏菌、2株志贺氏菌、2株肠出血性大肠杆菌O157∶H7的基因组DNA为模板，采用25μL反应体系：上下游引物（10mmol/L）各0.5μL，10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L each）2μL，Mg2+（25mmol/L）2μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，灭菌超纯水16.25μL，模板1μL；反应程序：94℃预变性4min，94℃45s、60℃90s、72℃1min，30个循环，72℃延伸7min，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后通过紫外成像进行检测；同时以上述程序扩增蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、致泻大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌等菌株的基因组DNA，验证所设计引物的特异性。

1.2.3.2 单重PCR灵敏度检测 分别挑取3种细菌（以鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、福氏志贺氏菌CMCC51572和肠出血性大肠杆菌O157∶H7 ATCC43888为例）于灭菌生理盐水中制成菌悬液，用比浊仪测试其浓度至108CFU/mL，然后用灭菌生理盐水按10倍梯度稀释，使菌液浓度为108～100CFU/mL，分别提取DNA后，按上述条件进行PCR扩增，分析单重PCR扩增的敏感性。

1.2.4 多重PCR反应

1.2.4.1 多重PCR反应的建立及产物鉴定 将沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7的基因组DNA进行组合作为模板，采用1.2.3.1的PCR反应条件进行扩增，并用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带，送往生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.4.2 多重PCR反应体系优化 实验流程如下所示：

a.单因素实验：对引物、Mg2+、dNTP、Taq酶4个因素设计7个水平进行实验，确定各因素的适宜水平范围：引物添加量：上下游引物（10μmol/L）依次各加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7μL；Mg2+（25mmol/L）添加量：依次加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μL；dNTP（2.5mmol/L）添加量：依次加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μL；Taq酶添加量：依次加入0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40μL。引物、Mg2+、dNTP、Taq酶4个因素的固定水平取7个水平的中间值，分别为0.4、2.0、2.0、0.25μL。

b.正交实验：单因素实验确定的最佳水平并不能代表整个反应体系的最佳组合，不同的组合方式也可能对反应体系产生影响。本研究选取单因素实验确定的各因素的3个最佳水平，选用L9（34）正交设计表（见表3）进行实验。

表3 L9（34）实验方案Table 3 The project of L9（34）experiment

1.2.4.3 退火温度优化 在实验确定的最佳反应体系基础上，对PCR退火温度进行优化筛选，依次设为55、56、57、58、59、60、61、62、63、64℃，从中确定最佳退火温度。

1.2.4.4 多重PCR灵敏度 取三种菌108～100CFU/mL各相同浓度的菌液等量混合，制成浓度为108～ 100CFU/mL的混合菌悬液，分别提取各稀释度的基因组DNA，按最优PCR反应体系进行扩增。

1.2.5 人工染菌 取经国标验证不含本研究的三种食源性致病菌的奶粉25g，加入225mL灭菌生理盐水均质，分别取三种菌过夜培养后的等浓度菌液各1mL加入7mL奶粉匀浆中混匀，然后以均质液作为稀释液进行10倍稀释，制成108～100CFU/mL的菌悬液，分别提取基因组DNA，按最优多重PCR体系进行扩增。

2 结果与分析

2.1 单重PCR反应

2.1.1 单重PCR扩增及引物特异性验证 3株沙门氏菌（鼠伤寒沙门氏菌14028、都柏林沙门氏菌50761、布伦登卢普沙门氏菌H9812）、2株志贺氏菌（福氏志贺氏菌51572、宋内志贺氏菌51592）和2株肠出血性大肠杆菌O157∶H7（肠出血性大肠杆菌O157∶H7 43888、肠出血性大肠杆菌O157∶H7 43889）的PCR扩增结果呈阳性，分别得到长度为495、620、252bp的目的片段，片段符合预期产物大小。其余9株菌株呈阴性，且无非特异性条带，表明本研究设计的3对引物特异性较好。

图1 单重PCR扩增结果及引物特异性验证Fig.1 The result of single PCR amplification and specificity of the primers

2.1.2 单重PCR扩增敏感性分析 由图2可知，单重PCR检测沙门氏菌的灵敏度达104CFU/mL，志贺氏菌的灵敏度达103CFU/mL，肠出血性大肠杆菌O157∶H7的灵敏度达104CFU/mL。

2.2 多重PCR反应

2.2.1 多重PCR反应的建立及产物鉴定结果 将三种食源性致病菌的基因组DNA组合后进行PCR扩增，均能得到目的片段，且相应的目的条带清晰，未发生交叉影响，表明本研设计三对引物可用于进行多重PCR扩增；将目的条带回收后测序，测序结果表明，沙门氏菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157∶H7的扩增序列与Genbank中公布的基因序列的同源性均达98%以上，从而证实PCR产物确为目的产物。

图2 单重PCR检测三种致病菌的灵敏度Fig.2 Detection sensitivity of single PCR for three pathogens

图3 多重PCR反应的建立Fig.3 Establishment of multiplex PCR

2.2.2 多重PCR扩增条件优化结果

2.2.2.1 单因素实验结果 根据单因素实验结果（图3），引物、Mg2+、dNTP、Taq酶4个因素的3个适宜水平确定如下：引物（10mmol/L）适宜添加量：上下游引物各添加0.5、0.6、0.7μL；Mg2+（25mmol/L）适宜添加量：1.5、2.0、2.5μL；dNTP（2.5mmol/L each）适宜添加量：依次加入0.5、1.0、1.5μL；Taq酶适宜添加量：依次加入0.15、0.20、0.25μL。

图4 单因素实验结果Fig.4 The results of single-Factor experiment

2.2.2.2 正交实验结果 根据单因素实验确定的4因素3水平设计正交实验，由图5可见，在9组反应体系中，由于引物、Mg2+、dNTP、酶4个因素添加量组合的不同，扩增效果出现了显著差异，其中第8泳道效果最佳，因此，25μL多重PCR最佳反应体系确定为：上下游引物各0.7μL（10μmol/L），10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L each）0.5μL，Mg2+（25mmol/L）2μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，灭菌超纯水12.55μL，模板各1μL。

图5 正交实验优化多重PCR反应体系结果Fig.5 Optimization of multiplex PCR by orthogonal experiment design

2.2.3 最佳退火温度 如图6所示，选择55～64℃进行温度梯度PCR，均能得到目的条带，其中第3泳道的条带最亮，因此选择57℃作为本研究的最佳退火温度。

图6 最佳退火温度的选择Fig.6 Optimization of annealing temperature

2.2.4 多重PCR灵敏度检测 由图7可见，多重PCR同时检测沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7的灵敏度为104CFU/mL。一般而言，多重PCR的检测灵敏度低于单重PCR的灵敏度，因为在多重PCR反应体系中，模板与引物的结合几率可能随引物、模板的种类和添加量的增加而降低[18]，但本研究通过单因素实验和正交实验，优化出反应体系中各因素的最佳配比，有效地提高了模板与引物的结合效率，从而建立了与单重PCR灵敏度相当的多重PCR反应。

图7 多重PCR同时检测沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7的灵敏度

2.3 人工染菌

图8 牛乳样品人工染菌的检测灵敏度Fig.8 Detection sensitivity of artificial pollution

由图8可见，采用本研究建立的多重PCR方法检测人工污染奶粉中的三种致病菌，可得到清晰、分明的条带，检出限为106CFU/mL，比没有食品介质的多重PCR灵敏度低2个数量级，这是因为食品中的成分十分复杂，有些成为PCR抑制因素，可能降低PCR检测的灵敏度，有研究表明脂肪是导致PCR检测灵敏度下降的因素之一[19]。

3 结论与讨论

多重PCR是以单重PCR为基础发展而来的检测技术，该技术不仅可实现对多种致病菌同时进行鉴定，还可对同一致病菌不同耐药性[20-22]或血清型[23]进行检测。到目前为止，多重PCR因其高效、快速、低成本等优点而被广泛用于食源性致病菌的检测中。然而，多重PCR并不是简单的混合体系反应，检测过程中会受多种因素的影响，首先，多重PCR的引物设计是关键，Settanni L[24]通过实验表明为了确保一对引物只能特异性扩增出唯一的产物，引物设计应更长、解链温度（Tm）应更高。本研究选取编码沙门氏菌侵袭蛋白的invA基因、编码志贺氏菌侵袭性质粒抗原的ipaH基因及编码大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶的uidA基因作为目的基因，结果显示引物特异性较好；其次，引物、dNTP、Mg2+、Taq酶、退火温度等是影响PCR的重要因素，多重PCR体系因存在多对引物、多个模板而更加复杂，鉴于此，本研究结合单因素实验和L9（34）正交实验建立了多重PCR的最佳反应体系（25μL）：上下游引物各0.7μL（10μmol/L），10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L each）0.5μL，Mg2+（25mmol/L）2μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，灭菌超纯水12.55μL，三种细菌的模板DNA各1μL，经验证该反应的特异性较好。但相比于其他PCR反应，本研究中的单重PCR及多重PCR的灵敏度相对较低，主要影响因素可能是模板，本研究采用试剂盒法提取基因组DNA，得到的模板纯度高，但量少，且因客观条件限制，不能对模板浓度进行测定，无法摸索最适反应浓度，可能对反应灵敏度造成了影响。后续研究中可在模板提取的最后一步适当少加入TE溶液溶解，以提高DNA模板的浓度；也可采用多种基因组提取方法，并进行效果对比；另外，在确定模板浓度的基础上，可将其加入到单因素实验、正交实验中，寻找反应各因素的最佳配比。此外，本研究所确立的多重PCR体系可直接从人工污染的奶粉中检测出沙门氏菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157∶H7 3种致病菌，从样品处理到检测结束仅需5h左右，但灵敏度降低了两个数量级，主要是由于样品中存在诸多干扰成分，如脂肪、多糖、蛋白质等均会影响多重PCR的检测灵敏度，可通过对样品进行增菌培养后再进行多重PCR来解决这一问题[25-26]。在后续的研究中，我们也将进一步探索提高检测灵敏度的途径，以期建立更加高效、稳定、灵敏的多重PCR方法。

本研究建立的多重PCR体系可同时检测沙门氏菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157∶H7，具有操作简单、快速、准确等优点，为食源性致病菌的快速筛查提供了重要的技术支持。

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Establishment of a multiplex PCR detection method for three foodborne pathogens

SHU Chang，JIANG Chen-lu，ZHONG Ci-ping，LI Lin*
（College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China）

Objective：To establish a rapid multiplex polymerase chain reaction（PCR）method for the simultaneous detection of Salmonella spp.，Shigella spp.and Enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7.Methods：Three pairs of primers had been designed based on the invA gene in Salmonella spp.，ipaH gene in Shigella spp. and uidA gene in Enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7，single-factor experiment and L9（34）orthogonal experiment were used to optimize multiplex PCR amplification system，and the sensitivity of multiplex PCR was also analyzed.Results：Fragments of 495，620，252bp were obtained respectively.Under the optimized condition，the detection sensitivity of multiplex PCR for three pathogens was 104CFU/mL.This method had been applied to artificial experiment，the result was accurate and steady，which could be obtained within 5h. Conclusion：A simple，specific and sensitive multiplex PCR method had been established and it was valuable for rapid monitoring and diagnosis for Salmonella spp.，Shigella spp.and Enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7.

foodborne pathogens；multiplex polymerase chain reaction（PCR）；Salmonella spp.；Shigella spp.；Enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7

TS201.3

A

1002-0306（2014）12-0049-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.001

2013－10－09 *通讯联系人

舒畅（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品安全与质量控制。