桂枝提取物抑菌活性研究

周梦娇，万春鹏，陈金印（江西农业大学农学院，江西省果蔬保鲜与无损检测重点实验室，江西南昌330045）

桂枝提取物抑菌活性研究

周梦娇，万春鹏，陈金印*
（江西农业大学农学院，江西省果蔬保鲜与无损检测重点实验室，江西南昌330045）

以柑橘青、绿霉菌及猕猴桃灰霉菌等17种植物病原菌为指示菌，分别采用杯碟法、菌丝生长速率法对桂枝提取物的抑菌活性进行研究，结果表明桂枝提取物具有较广泛的抑菌谱，对这17种供试病原菌均表现出一定的抑制效果，其中对柑橘青、绿霉的抑菌圈大小分别为（32.67±0.23）mm和（30.50±0.17）mm，最小抑菌浓度（MIC）分别为3.125mg/mL和6.25mg/mL，最小杀菌浓度（MFC）分别为6.25mg/mL和12.5mg/mL，而在其他15种植物病原菌中，桂枝提取物对车前草穗枯菌的活性最强，半抑制浓度（EC50）为0.4386mg/mL，对其他病原菌的EC50为1～22mg/mL。

桂枝，植物病原菌，抑菌活性

植物病害是农业生产活动和采后贮藏最主要的瓶颈之一，据联合国粮农组织（FAO）统计，每年因植物遭受病害造成的减产平均损失为总产量的10%～15%[1-2]。目前植物病害防治主要依靠化学杀菌剂，但其残留量大，对人和环境都有很大的危害，且使用的持续性及普遍性导致很多植物病原菌产生抗药性[2]，随着人类“回归自然”的呼声越来越高，国际社会把目光转向了高效、低成本、低毒、低残留、不易产生抗性的天然植物提取物，如艾蒿、连翘、丁香、苦参等植物提取物因其具有较强的抗氧化性及抑菌效果，被广泛应用于食品防腐剂、抗氧化剂、果蔬贮藏保鲜剂、生物农药等方向[3]。我国中草药资源丰富，大部分中草药在中药领域具有广泛研究应用，但只有少部分于植物病害防治方面得到了探究，因而亟需扩大中草药提取物及植物病原菌的筛选范围。

桂枝（Ramulus cinnamomi）是樟科（Cinnamonum）常绿乔木植物肉桂（Cinnamomum cassiaPresl.）的干燥嫩枝，主要分布在广西、广东、云南、福建和海南等地，其性味辛、甘、温，有发汗解肌、温经通脉之功效，中医多用于治疗风寒感冒、脘腹冷痛和关节痹痛等症[4]，是一种运用极其普遍的中药，具有较好的抑菌[5]、抗病毒[6]、抗氧化[7]和抗过敏[8]等药理作用。目前对桂枝的研究多局限于医药方面，而将其运用于植物病害防治方面未见报道。本实验通过研究桂枝提取物对17种常见植物病原菌的抑菌活性，为充分开发利用桂枝资源及植物病害田间防治实验提供一定的理论基础。

1 材料与方法

的测定 二倍稀释法稀释桂枝提取液，并制得提取液终浓度为0.195～100mg/mL含药培养基，平板涂布法将供试菌液均匀涂于培养基上，设置空白对照组（培养基不接种菌）、菌液对照组（培养基接种菌），将其置于28℃的培养箱中培养2d，以无菌生长的培养皿的含药浓度为其MIC，将无菌生长的培养皿继续培养7d后观察，以无菌生长的培养皿的含药浓度为其MFC[11]，每个处理重复3次。

1.2.2.4 桂枝提取物对其他15种植物病原菌抑菌活性的室内毒力测定 参考方法[12]，无菌条件下，将不同体积的桂枝提取液加入到融化的PDA中，制成终浓度分别为25、5、1、0.2mg/mL的含药培养基，以纯PDA培养基为对照，用直径6mm打孔器打取活化好的各供试菌菌落的边缘菌块，分别将其转接到各不同浓度的含药PDA培养基及对照培养基中，每个处理重复3次，并将其置于28℃恒温培养箱中培养，7d后记录各菌落生长情况，并用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率：抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 桂枝提取物对柑橘青、绿霉菌的抑制活性

由表1可知，桂枝提取物对柑橘青、绿霉菌的菌丝生长表现出不同的抑制作用，对柑橘青、绿霉菌的抑菌圈大小（32.67±0.23）mm、（30.50±0.17）mm，此外，桂枝提取物在较低浓度对供试菌即表现出较好的抑制作用，对柑橘青、绿霉菌的MIC分别为3.125mg/mL和6.25mg/mL，MFC分别为6.25mg/mL和12.5mg/mL，因而柑橘青霉菌对桂枝提取物敏感性较优于绿霉菌。

2.2 桂枝提取物对其他15种植物病原菌的室内毒力测定

表1 桂枝提取物对柑橘青、绿霉菌的抑制效果Table 1 Antifungal activity of Ramulus cinnamomi extracts on P.italicum and P.digtium

以桂枝提取液的浓度对数值为横坐标，平均抑制率的机率值为纵坐标，用DPS软件绘制标准曲线，求得桂枝提取液对15种供试植物病原菌的毒力回归方程，相关系数，EC50及其置信区间如表2所示。由表2可知，桂枝提取液对15种供试菌均有一定的抑菌活性，EC50能有效反映杀菌剂对病原菌抑制活性大小，EC50数值越小，说明杀菌剂对病原菌抑制活性越强。本实验中桂枝提取液对15种供试菌EC50值由小到大依次为：车前草穗枯病菌，猕猴挑拟茎点霉菌、玉黍蜀赤霉菌、枣拟茎点霉菌、水稻纹枯菌、西瓜枯萎菌、辣椒疫霉菌、茄褐纹菌、柑橘酸腐菌、莴苣菌核核盘菌、柑橘炭疽菌、猕猴桃灰霉菌、葡萄座腔菌、柑橘黑

1.1 材料与仪器

桂枝（Ramulus cinnamomi） 2013年3月5日购于江西省樟树市华丰药业公司；95%乙醇 分析纯；PDA培养基 自制；柑橘青霉菌（Penicillium italicum）、柑橘绿霉菌（Penicillium digitatum）、柑橘炭疽菌（Colletotrichum glecosporioides）、柑 橘 酸 腐 菌（Geotrichum candidum）、柑橘黑斑菌（Phoma citricarpa）、猕猴桃灰霉菌（Botrytis cinerea）、猕猴桃拟茎点霉菌（Phomopsis asparagi）、枣拟茎点霉菌（Phomopsis mauritiana）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria parva）、莴苣菌核核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、茄褐纹菌（Phomopsis vexans）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、芝麻镰孢茎枯菌（Fusarium oxysporum）、水稻纹枯菌（Rhizoctonia solani）、玉黍蜀赤霉（Gibberella zeae）、西瓜枯萎菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）和车前草穗枯菌（Diaporthe angelicae） 均由江西农业大学植物病理实验室提供。

5804R冷冻离心机 德国Eppendorf公司；R-3旋转蒸发仪 瑞士BUCHI公司；KQ-500B超声波清洗机 昆山超声仪器有限公司；YXQ-LS-70A立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司；MIR-254恒温培养箱 日本三洋公司；LX-300冷却水循环机 北京长流科学仪器公司；HS-1300U超净工作台 苏静集团苏州安泰公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桂枝提取物的制备 参考课题组前期提取方法[9]，将桂枝于60℃真空干燥箱烘干后粉碎，过40目筛，取筛下粉末用95%乙醇溶剂超声波辅助浸提2h，提取液减压浓缩后离心，乙醇定容得到1g药材/mL桂枝提取液。

1.2.2 抑菌活性的测定

1.2.2.1 菌种活化及菌悬液的配制 无菌条件下，将柑橘青、绿霉菌接种到斜面PDA培养基上，于28℃恒温培养箱中活化一周，用无菌水将其分别洗入三角瓶中，过滤，将滤液充分摇匀制成孢子悬浮液，用血球计数板计数，使各菌液孢子浓度均为108cfu/mL。其余15种病原菌用直径6mm打孔器打取各供试菌菌落的边缘菌块，并转接到PDA培养基中，于28℃恒温培养箱中活化一周，备用。

1.2.2.2 桂枝提取物对柑橘青、绿霉菌抑菌活性的测定 无菌条件下，吸取1mL供试菌液于99mL融化的PDA培养基中，使菌液终浓度为106cfu/mL[10]，摇匀后倒平板，采用杯碟法[9]，对桂枝提取物进行抑菌活性测定，重复3次，将各平板置于28℃的恒温培养箱中培养，48h后采用十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.2.2.3 桂枝提取物对柑橘青、绿霉菌的MIC和MFC斑菌和芝麻镰孢茎枯菌。桂枝提取液对车前草穗枯病菌的抑菌效果最好，EC50为0.4386mg/mL，其毒力回归方程为y=6.5999+4.0511x，斜率较大为4.0511，说明该病原菌对桂枝提取液较敏感。对猕猴挑拟茎点霉菌、玉黍蜀赤霉菌等12种供试菌的抑制效果次之，EC50分别在1～10mg/mL之间，对柑橘黑斑菌及芝麻镰孢茎枯菌的抑制效果最差，EC50分别为13.9462mg/mL及21.1945mg/mL。

表2 桂枝提取液对15种植物病原菌的抑菌效果Table 2 Antifungal activity of Ramulus cinnamomi against 15 phytopathogens

3 结论

桂枝对柑橘青、绿霉菌、猕猴桃灰霉菌等17种常见植物病原菌均表现出一定的抑制作用，因而桂枝提取物中含有抑制多种植物病原菌生长的活性成分，有较为广泛的抑菌谱，为充分开发利用桂枝这一植物资源，需进一步完善其抑菌活性物质提取、分离、纯化方法，并进行安全毒理学评价，再结合构效关系、化学仿生合成以满足产业化需求。

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Study on antifungal activity of Ramulus cinnamomi

ZHOU Meng-jiao，WAN Chun-peng，CHEN Jin-yin*
（Jiangxi Key Laboratory for Postharvest Technology and Non-destructive Testing of Fruits&Vegetables，College of Agronomy，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

Seventeen kinds of phytopathogens such as Penicillium italicum，Penicillium digitatum and Botrytis cinerea were used as indicators to explore the antifungal activities of Ramulus cinnamomi by cylind-plate and mycelial growth rates methods，respectively.The results showed that Ramulus cinnamomi had a broader spectrum antifungal activity against the 17 sorts of tested phytopathogens，the inhibition zones against P.italicum and P.digitatum were（32.67±0.23）mm and（30.50±0.17）mm，respectively.While the minimum inhibitory concentrations（MIC）gainst P.italicum and P.digitatum were 3.125mg/mL and 6.25mg/mL，respectively，and the minimum fungicidal（MFC）concentrations were 6.25mg/mL and 12.5mg/mL，respectively.Meanwhile，the toxicity of indoor test of Ramulus cinnamomi against the other 15 phytopathogens showed that Ramulus cinnamomi extracts had the best antifungal activity on Diaporthe angelicae with the EC50value of 0.4386mg/mL. The antifungal activities against other tested pathogens with EC50values ranged from 1 to 22mg/mL.

Ramulus cinnamomi；phytopathogens；antifungal activity

TS201.2

A

1002-0306（2014）12-0096-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.011

2013－09－16 *通讯联系人

周梦娇（1990-），女，硕士研究生，研究方向：柑橘采后贮藏技术。

“十二五”科技支撑计划项目（2012BAD38B03-2）；国家自然科学基金项目（31160343）；江西省教育厅科技落地计划项目（111）；江西省“赣博英才555工程（2012）；农业科技成果转化资金项目（2011GB2C500017）；江西省博士后科研择优资助项目（2013KY31）；留学人员科技活动项目（人社厅函[2013]277号）；中国博士后科学基金第54批面上项目（2013M541870）。