不同检测方法分析紫甘薯红色素的抗氧化能力

孙晓侠，王改玲，吴珊珊，钱时权，马 龙，许 晖（蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠233030）

不同检测方法分析紫甘薯红色素的抗氧化能力

孙晓侠，王改玲，吴珊珊，钱时权，马 龙，许 晖
（蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠233030）

采用比色法（分光光度法）、化学发光法、荧光法分析了紫甘薯红色素对体外活性氧（O2-·和·OH）的清除作用和对体外脂质体过氧化产物丙二醛（MDA）生成的抑制作用。结果表明：紫甘薯红色素对邻苯三酚自氧化体系产生的O2-·具有一定的清除作用，但低于对照抗坏血酸（VC），采用化学发光法测定时，这种清除效果强于采用比色法；色素对Fenton反应产生的·OH具有清除作用，采用化学发光法测定时，这种清除效果最好（高于VC），荧光法次之（稍高于VC），比色法最差（高浓度时显著低于VC）；对Fe2+-H2O2诱导小鼠肝组织匀浆脂质过氧化产物丙二醛的生成具有抑制作用，采用TBA荧光光度法测定时，这种抑制作用（略低于VC）强于采用TBA比色法（高浓度时显著低于VC）。与比色法相比，化学发光法和荧光法用于分析花色苷类色素抗氧化能力的大小灵敏度高，选择性强，能减少由于花色苷类色素自身在可见光区的光谱吸收对测定结果的干扰。

比色法，化学发光法，荧光法，紫甘薯红色素，活性氧，丙二醛

紫甘薯（Ipornoea batatas L.）属旋花科一年生草本植物，薯肉呈深紫红色，富含天然花色苷类红色素，是甘薯中特有的品种。文献报道，紫甘薯红色素的主要成分是酰基化的花青素苷及甲基花青素苷[1]，具有抗氧化、抑菌、防癌、保护肝脏、保护视力、抗突变、抗衰老、调节血压、血糖和血脂水平等生理功能[1-3]，是一种具有广阔开发利用前景的天然食药兼备的“功能性食用色素”资源。

评价物质抗氧化活性的方法很多，主要有比色法（分光光度法）、荧光化学发光法和荧光光度法等，其中大多采用比色法，因其所需仪器设备简单，测定成本低，易实施。本课题组曾首次采用荧光化学发光法和荧光光度法对紫甘薯花色苷体外抗氧化活性进行了实验研究，表明紫甘薯花色苷在模型中表现出相当的清除活性氧的能力和抑制小鼠组织匀浆脂质过氧化的能力[4]。为了避免单一方法研究紫甘薯红色素抗氧化活性的局限性，并比较不同检测方法的灵敏性和适用性，本实验尝试在同一体系模型下采用比色法、荧光化学发光法和荧光光度法分析紫甘薯红色素的抗氧化能力，以期为评价天然花色苷类色素抗氧化能力检测方法的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫甘薯 市售；雌性昆明种小鼠 体重（30±3g），购自北京军事医学科学院实验动物中心；鲁米诺（3-Aminophthalhydrazide，98%） 美国ACROS ORGANICS；硫代巴比妥酸（2-Thiobarbituric acid，TBA） Fluka产品；邻苯三酚、EDTA、抗坏血酸、苯甲酸、碳酸钠、碳酸氢钠、盐酸、三氯乙酸、H2O2、FeSO4等 均为分析纯。

SP-2102U型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；Fluoroskan Ascent FL型荧光/化学发光分析仪 美国Thermo Electron Corporation；RF-5301型荧光分光光度计 日本岛津公司；DY89-Ⅰ型电动玻璃匀浆机 宁波新芝科器研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 紫甘薯红色素的制备工艺流程[4]紫甘薯→清洗→切片→以料液比1∶3（g∶mL）加入0.5%盐酸溶液浸提6h→过滤→二次浸提→过滤→合并滤液→AB-8大孔树脂吸附→75%乙醇溶液洗脱→真空浓缩→喷雾干燥→样品→备用。

用于本实验的紫甘薯红色素按上述制备工艺流程制备，色素粉色价为74.2（1%，530nm）。

1.2.2 肝组织匀浆的制备 取正常昆明种小鼠，禁食16h后，脱臼处死，迅速取出肝组织，用冷生理盐水（4℃）洗净血液，于冷生理盐水中剪碎，加冷生理盐水冰浴下于电动玻璃匀浆机中匀浆，制备10%肝组织匀浆，稀释制备1%肝组织匀浆。

1.2.3 对活性氧的清除作用

1.2.3.1 对O2-·的清除作用 利用碱性邻苯三酚自氧化体系产生O2-·，分别采用比色法和鲁米诺化学发光法测定色素对O2-·清除作用。

a.比色法：参照文献[5]的方法进行测定。吸光度值均重复测定三次，取三次的平均值，清除率计算公式见式（1）。

式中，A0为空白吸光度值，Ai为样品吸光度值。

b.鲁米诺化学发光法：参照文献[4]的方法进行测定。发光强度峰值均重复测定三次，取三次的平均值，清除率计算公式见式（2）。

式中，CP0为空白发光强度峰值，CPi为样品发光强度峰值。

添加的色素溶液的浓度范围均设为0.1～10mg/mL，以抗坏血酸为标准抗氧化剂。

1.2.3.2 对·OH的清除作用 利用Fenton反应产生·OH，分别采用比色法、鲁米诺化学发光法、苯甲酸荧光法测定色素对·OH的清除作用。

a.比色法：参照文献[6]的方法进行测定。吸光度值均重复测定三次，取三次的平均值，清除率（%）的计算方法见式（1）。

b.鲁米诺化学发光法：参照文献[4]的方法进行测定。发光强度峰值均重复测定三次，取三次的平均值，清除率（%）的计算方法见式（2）。

c.苯甲酸荧光法：参照文献[4]进行测定。荧光强度值均重复测定三次，取三次的平均值，清除率计算公式见式（3）。

式中，F0为空白荧光强度值，Fi为样品荧光强度值。

添加的色素溶液的浓度范围均设为0.01～5mg/mL，以抗坏血酸（VC）为标准抗氧化剂。

1.2.4 对Fe2+-H2O2诱导的小鼠组织匀浆脂质过氧化的抑制作用[7-8]TBA比色法和TBA荧光光度法测定色素对亚油酸脂质体过氧化的抑制作用。

取1%新鲜肝组织悬浮液1mL，加入不同浓度的紫甘薯红色素溶液0.2mL，再加入0.1mL 6mmol/L Fe2SO4，0.1mL 60mmol/L的H2O2，在37℃下水浴1h后，加入1mL 15%三氯乙酸（TCA）终止反应，再加入1mL 6.7%硫代巴比妥酸（TBA），于沸水浴中显色15min，冷却后离心。对照用去离子水代替样液，以抗坏血酸为标准抗氧化剂。按下述方法进行测定其抑制作用。

a.TBA比色法：取上清液于722S分光光度计532nm下测定吸光度Ai值，重复测定三次，取三次的平均值，抑制率（%）的计算方法见式（1）。

b.TBA荧光光度法：取上清液于RF-5301荧光分光光度计上（波长：Ex=515.0nm，Em=553.0nm，狭缝：Ex=5.0nm，Em=3.0nm）测其荧光强度Fi，重复测定三次，取三次的平均值，抑制率（%）的计算方法见式（3）。

1.2.4 仪器处理方法 为防止玻璃仪器沾染有机物，本实验中所用玻璃仪器均采用以下步骤处理：a.用洗液浸泡；b.自来水冲洗；c.发烟硝酸浸泡1h以上；d.蒸馏水漂洗干净；e.蒸馏水煮沸；f.蒸馏水漂洗三次后使用。下同。

2 结果与分析

2.1 对活性氧的清除作用

2.1.1 对O2-·的清除作用 比色法和鲁米诺化学发光法测定的紫甘薯红色素及标准抗氧化剂对照物VC对O2-·的清除能力的结果见图1。

由图1可见，在实验浓度范围内，化学发光法和比色法测定实验结果均表明，紫甘薯红色素和VC对由碱性邻苯三酚自氧化体系产生的O2-·均具有清除作用，清除效果均随其质量浓度的增大而增大，但紫甘薯红色素的清除效果低于VC，采用化学发光法测定的清除率数值均大于采用比色法，可知采用化学发光法时色素显示出更强的清除O2-·能力。比色法，由于所需仪器设备简单，测定成本低，易实施等诸多优势，目前是实验室最常采用的物质清除O2-·作用的测定方法，由实验结果可知，跟比色法相比，化学发光法测定紫甘薯红色素的清除能力灵敏度更高，检测更快速。

图1 不同检测方法测定的色素对O2·-的清除作用Fig.1 Scavenging effect of the pigment on superoxide anion using different detection methods

2.1.2 对·OH的清除作用 在所有活性氧自由基中，·OH是最活泼也最具危害性的自由基，而且很难消除，已发现许多抗氧化剂清除O2-·，但却不能清除·OH。比色法、鲁米诺化学发光法、苯甲酸荧光法测定的紫甘薯红色素及标准抗氧化剂对照物VC对·OH的清除能力的结果见图2。

图2 不同检测方法测定的色素对·OH的清除作用Fig.2 Scavenging effect of the pigment on hydroxyl free radicals using different detection methods

由图2可见，在实验浓度范围内，化学发光法、荧光法和比色法测定实验结果均表明，紫甘薯红色素和VC对由Fenton反应产生的·OH均具有清除作用，这种清除作用均随其质量浓度的增大而增大（除采用比色法测定色素的清除作用曲线外）。采用化学发光法和荧光法时，紫甘薯红色素对·OH的清除效果高于VC，前者的这种差异更大，而采用比色法测定时，清除效果随色素质量浓度的增大先增大后降低，当浓度小于1mg/mL时，清除效果高于VC，大于1mg/mL时低于VC，随着浓度增大，清除率下降趋势越大，这与化学发光法和荧光法的结果不同，作者认为可能是因为比色法的测定波长在510nm处，紫甘薯红色素自身在该波长有较强吸收（紫甘薯花色苷的最大吸收波长在530nm处[4]），所以当浓度大于2mg/mL时，残留的色素对实验结果产生较大干扰，使得清除率降低。

由此可知，采用鲁米诺化学发光法、苯甲酸荧光法和比色法测定相同浓度的色素清除·OH的能力大小时，结果存在差异，化学发光法得出的清除效果最好，荧光法次之，比色法最低，可知比色法不适合用于测定花色苷类色素对由Fenton反应（细胞色素C-Cu2+-H2O2）产生的·OH的清除作用。

2.2 对Fe2+-H2O2诱导的小鼠肝组织匀浆脂质过氧化的抑制作用

TBA比色法和TBA荧光光度法测定的紫甘薯红色素及标准抗氧化剂对照物抗VC对Fe2+-H2O2诱导的小鼠肝组织匀浆脂质过氧化抑制作用的结果见图3。

图3 不同检测方法测定的色素对丙二醛生成的抑制作用Fig.3 Inhibition effect of the pigment on the generation of MDA using different detection methods

由图3可见，在实验浓度范围内，TBA荧光光度法和TBA比色法测定实验结果均表明，紫甘薯红色素和VC对Fe2+-H2O2诱导的小鼠肝组织匀浆脂质过氧化产物丙二醛的生成具有抑制作用，抑制效果均随其质量浓度的增大而增大（除采用TBA比色法测定色素的清除作用曲线外），荧光光度法测定的色素的抑制能力强于比色法，但均低于VC。TBA荧光光度法测定结果表明，高浓度的色素溶液的抑制效果好，如8mg/mL的色素溶液对丙二醛生成的抑制率达到90.2%，略低于相同浓度下VC的抑制率100%。TBA比色法测定结果表明，紫甘薯红色素对丙二醛生成的抑制率低于VC，且随其质量浓度的增大先增大后降低，随着浓度增大，清除率下降趋势越大，作者认为可能是因为比色法的测定波长在532nm处，即TBAMDA复合物在532nm处有最大吸收，而这与紫甘薯红色素的最大吸收波长530nm几乎吻合，所以当浓度大于约1mg/mL时，残留的色素对实验结果产生较大干扰，使吸光度值Ai增大，从而清除率降低。

采用TBA荧光光度法和TBA比色法测定相同浓度的色素清除MDA的能力大小时，结果存在很大差异，TBA荧光光度法测定的清除率的数值较高，在高浓度时这种差异更大，可知TBA比色法不适合直接用于测定花色苷类色素对Fe2+-H2O2诱导小鼠肝组织匀浆脂质过氧化产物丙二醛生成的抑制作用。

3 结论

紫甘薯红色素对邻苯三酚自氧化体系产生的O2-·具有一定的清除作用，但低于对照抗坏血酸（VC），采用化学发光法测定时这种清除效果强于采用比色法；色素对Fenton反应产生的·OH具有清除作用，采用化学发光法测定时这种清除效果最高（高于VC），荧光法次之（稍高于VC），比色法最差（高浓度时显著低于VC）；色素对Fe2+-H2O2诱导小鼠肝组织匀浆脂质过氧化产物丙二醛的生成具有抑制作用，采用TBA荧光光度法测定时这种抑制作用（略低于VC）强于采用TBA比色法（高浓度时显著低于VC）。

通过对紫甘薯红色素对活性氧自由基的清除能力和对脂质过氧化产物丙二醛生成的抑制作用的测定，结果表明，与比色法相比，化学发光法和荧光法表现出灵敏度高，选择性强，检测快速，能减少由于色素自身在可见光区的光谱吸收对测定结果的干扰。因此，化学发光法和荧光法适合用于对花色苷类色素抗氧化能力的分析。

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Antioxidation analysis of red pigment from purple sweet potato by different test methods

SUN Xiao-xia，WANG Gai-ling，WU Shan-shan，QIAN Shi-quan，MA Long，XU Hui
（Department of Biology and Food Engineering，Bengbu College，Bengbu 233030，China）

The scavenging ability on ROS and products of lipid peroxidation of red pigment from purple sweet potato was analysed by means of colorimetry（spectrophotometry），chemiluminescence，fluorospectrophotometry，in models for generation of superoxide anion，hydroxyl radicals malonaldehyde（MDA）.The results showed that the red pigment had certain scavenging effects on superoxide anion produced by pyrogallol autoxidation system，but lower than L-Ascorbic acid（VC），and the scavenging effects determined by chemiluminescence was stronger than colorimetry.The pigment had scavenging effects on hydroxyl free radical produced by Fenton reaction，and the effects determined by chemiluminescence（stronger than VC）was the strongest，next fluorescence（stronger slightly than VC），final colorimetry（lower evidently than VCat high concentrations）.The pigment also had inhibitory action on generation of MDA，the production of lipid peroxidation induced by Fe2+-H2O2on rat liver tissue homogenates in vitro，and the action determined by TBA fluorospectrophotometry（lowerer slightly than VC）was stronger than TBA colorimetry（lower evidently than VCat high concentrations）. Compared with colorimetry，chemiluminescence and fluorescence had high sensitivity and strong selectivity，and overcome the interference from spectral absorption of the pigment at the visible light on the test results.

colorimetry；chemiluminescence；fluorescence；red pigment from purple sweet potato；ROS；malonaldehyde

TS202.3

A

1002-0306（2014）12-0087-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.009

2013－07－30

孙晓侠（1979-），女，硕士研究生，助教，研究方向：天然产物活性成分。

安徽省高校省级自然科学研究项目（KJ2011B089）；食品科学与工程省级教学团队（20101094）。