miRNA-1对大鼠心肌细胞凋亡的影响
2014-02-28王霁翔丛洪良
王霁翔 丛洪良
微小RNA(MicroRNA,miRNA)是高度保守的内源性单链非编码RNA,长度为18~25个核苷酸。它们以不完全互补的方式与成熟mRNA结合,抑制mRNA的翻译或使mRNA降解,在转录后水平调节蛋白质的表达。近年来发现,miRNA与心血管系统疾病有非常密切的关系,心脏疾病伴随着miRNA表达谱的变化;改变细胞内或细胞外的miRNA表达可以引起心肌梗死、肥大或心律失常等心脏疾病[1-2]。其中,miRNA-1被认为具有心肌特异性,与心肌细胞的病理改变密切相关[3-4]。本实验旨在通过研究miRNA-1水平与凋亡调控基因Bcl-2表达变化的关系,探讨miRNA-1在心肌细胞凋亡中的作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 大鼠H9c2心肌细胞株购自中科院上海细胞库。DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美国Gibco公司),转染试剂Lipofectamine 2000、RNA提取试剂Trizol、逆转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂、real-time PCR试剂盒(美国Invitrogen公司),miRNA-1 mimics和miRNA阴性对照片段由上海吉玛公司设计并合成,Bcl-2抗体(ABCAM公司),β-actin抗体(Proteintech公司),FITC Annexin V凋亡试剂盒(美国BD公司)。ABI 7500型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司),流式细胞仪(美国BD公司)。
1.2 细胞培养和转染 大鼠H9c2心肌细胞株在含有10% FBS的高糖DMEM培养基中,于37℃、5%CO2的孵箱中培养。平均每3 d传代1次。当细胞生长密度达到约70%融合时,换液备用。24 h后将细胞分为3组。空白对照组:常规条件培养的H9c2细胞;阴性对照组:根据转染试剂Lipo⁃fectamine 2000的操作说明,转染随机合成的miRNA阴性对照片段;miRNA-1组:转染miRNA-1 mimics片段的H9c2细胞。将溶于无血清DMEM中的miRNA-1 mimics与Lipo⁃fectamine 2000轻轻混合后室温孵育20 min,然后将此混合物加入到细胞培养液中,放入培养箱中继续培养48 h。
1.3 real-time PCR检测细胞miRNA-1水平 按照RNA提取试剂Trizol的说明书进行操作,提取细胞总RNA,紫外分光光度计检测总RNA的浓度和纯度,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。逆转录合成cDNA后进行real-time PCR检测,以U6作内参。PCR扩增条件为:95℃预变性5 min;95℃10 s,60℃30 s,40个循环。目的基因的相对表达量根据公式2-△Ct计算得到(△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因)。
1.4 细胞生存率检测 转染前1 d,将对数生长期的细胞接种于96孔板中,每孔1×104个细胞,24 h后分别转染miRNA-1 mimics和miRNA阴性对照片段,以不进行转染处理的细胞作为空白对照,以只加培养液的孔作为调零孔。48 h后,向96孔板中的各组细胞中加入5 g/L的噻唑蓝(MTT)20 μL,于37℃、5%CO2培养箱中孵育4 h。吸净各孔液体,加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL,室温下置于水平摇床上至结晶完全溶解。用酶标仪检测溶解液在490 nm波长处测定各孔的吸光度(A)值。以空白对照组的细胞生存率为100%,实验组细胞生存率(%)=实验组A值/空白对照组A值×100%。
1.5 流式细胞仪双染法检测细胞凋亡率 将处于对数生长期的细胞按照1×105/孔的密度接种于6孔板中,培养24 h后按照上述分组情况给予相应处理并继续培养48 h。胰酶消化收集各组细胞,PBS洗涤2次,用binding buffer重悬细胞并调整细胞浓度至1×106/mL,将细胞转移至流式专用管中,加入荧光标记的AnnexinV和PI试剂各5 μL,室温下避光孵育15 min,进行流式细胞仪检测。
1.6 定量PCR和Western Blot检测Bcl-2 mRNA和蛋白表达 按照1.3所述方法和公式提取细胞总RNA和计算目的基因Bcl-2的相对表达量。目的基因为Bcl-2,扩增长度为120 bp,内参基因为β-actin,扩增长度为105 bp。PCR条件:95℃预变性5 min;94℃15 s,退火60℃45 s,循环40次。
提取细胞总蛋白,BCA法定量。用蛋白溶解液调整蛋白浓度为5 g/L,取40 μg总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),切取包含Bcl-2(25 ku)或β-actin(42 ku)的凝胶进行转膜后,用5%脱脂奶粉封闭NC膜2 h,加一抗Bcl-2(1∶500)或β-actin(1∶1 000),4℃孵育过夜。TBST洗膜3次,每次2 mL,洗涤5 min。加入二抗(1∶500)常温孵育2 h。弃掉二抗,再次TBST洗膜3次,加入1 mL ECL发光液与膜充分接触,于成像系统进行图像采集。Bcl-2蛋白的相对表达量为Bcl-2蛋白条带与内参β-actin蛋白条带吸光度值的比值。
1.7 统计学方法 应用SPSS 11.5软件进行统计学分析,计量资料均以±s表示,多组间均值比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组细胞中miRNA-1的水平 3组miRNA-1水平比较差异有统计学意义(F=13.73,P<0.05)。miRNA-1组的miRNA-1相对表达量为3.46±1.28,明显高于空白对照组的0.66±0.14和阴性对照组0.71±0.16(均P<0.01)。
2.2 MTT法检测细胞生存率 3组间细胞生存率比较差异有统计学意义(F=69.60,P<0.05)。miRNA-1组细胞生存率为45.69%±8.13%,明显低于阴性对照组的97.87%±10.21%和空白对照组的100%± 8.61%(P<0.01)。
2.3 流式细胞仪双染法检测细胞凋亡 转染miR⁃NA-1 mimics 48 h后,细胞凋亡率为15.7%±2.82%,明显高于空白对照组(3.13%±0.45%)和阴性对照组(3.33%±0.70%),差异有统计学意义(F=54.06,P<0.01),见图1。
Figure 1 The result of apoptosis rate detected by FCM图1 流式细胞仪双染法检测细胞凋亡率
2.4 定量PCR和Western Blot检测Bcl-2 mRNA和蛋白表达结果 转染miRNA-1 mimics 48 h后,大鼠心肌细胞凋亡抑制因子Bcl-2的mRNA表达水平(1.45±0.08)明显低于空白对照组(2.38±0.13)和阴性对照组(2.39±0.15),差异有统计学意义(F=57.80,P<0.01)。而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义。Bcl-2的蛋白表达水平:空白对照组(0.95±0.05)和阴性对照组(0.94±0.11)比较差异无统计学意义,miRNA-1组(0.50±0.10)明显低于空白对照组和阴性对照组(F=23.76,P<0.01),见图2。
Figure 2 The expression levels of Bcl-2 protein in different groups图2 各组Bcl-2蛋白表达情况
3 讨论
miRNA在细胞发育的所有进程中起关键性作用,参与调节细胞的增殖、分化、衰老、死亡以及维持细胞的自我更新[5-6]。miRNA-1是近年来研究较多的与心脏疾病有关的microRNA[7-8],包括miRNA-1-1和miRNA-1-2两个成员,其基因长度均为21 bp。miRNA-1只在心肌和骨骼肌中表达,被认为具有肌细胞特异性,其表达受到转录因子如血清反应因子、肌细胞增强因子-2(Mef2)或MyoD和肌肉调节因子(MRFs)等的调节。miRNA-1与心肌细胞的病理状态密切相关。Yang等[3]研究发现,冠脉疾病患者的心肌组织中miRNA-1水平升高,其通过抑制K+通道Kir2.1亚基的编码基因KCNJ2和缝隙连接蛋白Cx43的编码基因GJA1转录后水平使细胞膜去极化、传导力降低,从而引起或加重心律失常的发生。Shan等[4]报道,缺血大鼠心肌组织高表达miRNA-1,caspase-3活性和线粒体膜电位均升高,细胞凋亡明显,并通过实验证实miRNA-1通过降低胰岛素样生长因子(IGF)的蛋白表达水平促进了心肌细胞的凋亡,引起了上述变化。
miRNA-1的靶基因多数为与细胞凋亡和增殖有关的基因,如PTMA[9]、PNP[10-11]等。Bcl-2是一种原癌基因,是阻遏细胞凋亡的核心分子,可以维持线粒体跨膜电位,抑制线粒体细胞色素C的释放,从而抑制下游caspase的激活,发挥抗凋亡作用。本研究结果表明,向心肌细胞内导入miRNA-1片段使心肌细胞高表达miRNA-1后,心肌细胞凋亡率升高,Bcl-2的表达水平降低。miRNA-1不仅作用于Bcl-2的转录后水平,也抑制了Bcl-2的转录水平,通过降低Bcl-2的mRNA和蛋白表达促进了心肌细胞的凋亡。
已有研究报道,拮抗一个miRNA有望纠正心力衰竭时的不良信号转导途径,具有成为预防和治疗靶标的潜能[12]。本研究进一步阐明了miRNA-1在心肌细胞凋亡中的作用,为miRNA-1的临床应用提供了实验依据。
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