利莫那班对肝纤维化C57小鼠肝组织大麻素受体1及α-SMA表达的影响*

叶立红 王翀奎 陈秀丽 杨 莉 戴二黑△

近年来，Hezode等[1]和Teixeira-Clerc等[2]先后发现大麻素及其受体在慢性肝病的发生发展过程中起着非常独特的作用，尤其大麻素受体(cannabinoid re⁃ceptor,CB)1在肝纤维化方面的研究逐渐受到重视。为了更深入研究CB1在肝纤维化发生、发展过程中的作用机制，本研究通过建立四氯化碳(CCl4)诱导的C57小鼠肝纤维化模型，观察肝组织中CB1和肝纤维化特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达变化，以及CB1拮抗剂利莫那班对CB1及α-SMA表达的影响，为今后以CB1为靶点进行抗肝纤维化治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物。C57小黑鼠，雄性，无特定病原体（SPF）级，33只，体质量（20±3）g,实验动物和饲料购自北京军事医学科学院动物实验室，合格证号：0029674。实验期间自由饮水和进食。（2）主要试剂及仪器。日本OLYMPUS双目显微镜，法国JOUAN MR型超低温冰箱，北京中科恒信彩色病理图文报告分析系统。CB1单克隆抗体、利莫那班购自美国Cayman Chemical公司，α-SMA单克隆抗体购自香港abcam公司，PV-6000免疫组化试剂盒及DAB显色液均购自北京中杉生物技术有限公司。CCl4购自天津市标准件科技有限公司，橄榄油购自上海晶纯试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 正式实验前选取3只小鼠进行预实验造模2周，2周后处死经病理证实纤维化模型成功。其余30只小鼠适应性喂养2周后，采用随机数字表法随机分为正常对照组、模型对照组及利莫那班组，每组10只。实验开始后每周一、四给予正常对照组腹腔注射橄榄油，橄榄油用量按0.01 mL/g体质量，模型对照组、利莫那班组腹腔注射10% CCl4造模，10%CCl4用量按0.01 mL/g体质量。每次腹腔注射前均检测体质量，调整注射剂量。造模2周后，于继续造模的同时，正常对照组和模型对照组生理盐水灌胃0.2 mL/次,1次/d，利莫那班组利莫那班灌胃10 mg/kg，1次/d[3],再连续实验6周，其中模型对照组和利莫那班组在实验过程中各死亡1只。

1.2.2 肝组织标本的收集与处理 各组小鼠分别在造模的第8周最后一次腹腔注射用药后4 h，称质量后4%水合氯醛腹腔注射麻醉处死，经下腔静脉无菌采血，并取出肝脏经冷生理盐水灌注冲洗残血后,切取部分肝组织放入10%福尔马林固定液中保存，用于病理诊断及免疫组化检测，其余肝脏组织放入EP管中迅速置液氮冻存备用。

1.2.3 病理学检测 所有肝脏标本均在10%福尔马林中固定96 h，依次用75%、80%、95%、100%乙醇进行梯度脱水，二甲苯透明，组织浸蜡，石蜡包埋。常规病理切片，切片厚度为4 μm，分别进行HE和Masson三色染色，中性树胶封片。光镜下观察肝组织形态学改变，并进行小鼠肝组织纤维化评分[4]。

1.2.4 免疫组织化学检测 采用SP法检测肝组织中CB1和 α-SMA表达，已知阳性片为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗为阴性对照，并进行半定量评分[5]。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件包进行分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，同一指标的组间比较采用单因素方差分析，分析前进行方差齐性检验，方差齐时用LSD法，若方差不齐则用Tamhane’s T2法，两指标间的相关性采用直线相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模6周时各组肝组织形态学改变 正常对照组肝小叶结构清晰，肝板以小叶中央静脉（CLV）为中心呈放射状排列，汇管区(P)仅见极少量胶原纤维，CLV周围未见胶原纤维。模型对照组CLV之间、CLV和P之间纤维间隔形成，部分区域纤维间隔较宽伴小叶结构紊乱，但未形成典型假小叶。利莫那班组肝脏CLV周围可见少量胶原纤维沉积，汇管区纤维组织呈星芒状增生。

2.2 CB1和α-SMA在肝组织中的表达及定位情况 CB1主要表达于肝细胞浆和肝窦内肝星状细胞（HSC）中，另外在肝窦内皮细胞和汇管区及纤维间隔的肌成纤维母细胞也有阳性表达。正常对照组CB1阳性表达细胞较少，仅3例在肝细胞及HSC少量表达；模型对照组可见大量阳性表达细胞，且随着坏死及纤维组织增生程度的加重，CB1阳性表达量也逐渐增加；利莫那班组也可见阳性表达，但阳性细胞较模型对照组明显减少，见图1～4。α-SMA在正常对照组仅少量表达于血管壁平滑肌细胞（中央静脉及汇管区的小叶间动脉、小叶间静脉的血管壁）；模型对照组α-SMA表达除分布于血管壁外，主要表达于肝窦内活化的HSC、汇管区和纤维间隔内，且阳性细胞数明显增多；利莫那班组α-SMA也主要表达肝窦内活化的肝星状细胞、汇管区和纤维间隔内，但阳性细胞较模型对照组明显减少，见图5、6。

Figure 1 The positive expression of CB1 in normal control group（SP,×100）图1 正常对照组肝细胞CB1阳性表达（SP,×100）

Figure 2 The positive expression of CB1 in portal area of model control group（SP,×100）图2 模型对照组汇管区内外CB1阳性表达（SP,×100）

Figure 3 The positive expression of CB1 in model rimonabant group（SP,×100）图3 利莫那班组CB1阳性表达（SP,×100）

Figure 4 The positive expression of CB1 in endothelial cells of model control group（SP,×400）图4 模型对照组肝窦及内皮细胞CB1阳性表达（SP,×400）

Figure 5 The positive expression of α-SMA in portal area of、model control group（SP,×100）图5 模型对照组汇管区α-SMA阳性表达（SP,×100）

Figure 6 The positive expression of α-SMA in portal area of model rimonabant group（SP,×100）图6 利莫那班组汇管区α-SMA阳性表达（SP,×100）

2.3 各组肝组织CB1、α-SMA和纤维化评分（S评分）比较 见表1。模型对照组、利莫那班组肝组织CB1评分、α-SMA评分及S评分均高于正常对照组（均P＜0.05），利莫那班组肝组织CB1评分、α-SMA评分及S评分均低于模型对照组(均P＜0.05)。

Table 1 Comparison of CB1,α-SMA and S scores between three groups表1 各组肝组织CB1、α-SMA和S评分结果比较（±s）

Table 1 Comparison of CB1,α-SMA and S scores between three groups表1 各组肝组织CB1、α-SMA和S评分结果比较（±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01，表2同；a与正常对照组比较，b与模型对照组比较，P＜0.05

正常对照组模型对照组利莫那班组F 0.60±0.36 3.57±0.68a 1.49±0.54ab 97.267＊＊10 99 0.89±0.50 5.18±1.29a 3.74±1.51ab 26.314＊＊0.92±0.47 5.32±1.31a 3.60±1.53ab 31.821＊＊

2.4 各组肝组织CB1、α-SMA及S评分之间的相关性 各组小鼠肝组织CB1评分、α-SMA评分及S评分之间均呈正相关（均P＜0.05），见表2。

Table 2 The correlation of CB1,α-SMA and S scores between three groups表2 各组肝组织CB1、α-SMA和S评分之间的相关性(r)

3 讨论

内源性大麻素系统是由大麻素及其相应受体构成的一个生理系统，目前认为内源性大麻素具有广泛的生物学作用，其作用发挥主要通过两种受体即CB1和CB2而实现[6]。研究表明，CB1的激活可促进肝纤维化的形成，利莫那班是第一个CB1特异性阻断剂，可有效减轻肝纤维化的发生[7]。本研究显示，正常对照组、模型对照组及利莫那班组CB1表达水平变化与S评分均呈正相关，证明肝组织CB1表达水平变化与肝纤维化进展程度相一致，因此CB1有促进肝脏纤维化产生的作用；同时，与模型对照组相比，利莫那班组肝组织CB1表达量明显降低，提示利莫那班可抑制纤维组织增生，从而起到抗肝纤维化的作用。研究认为内源性大麻素产生导致靶向性HSC的活化增殖是肝纤维化形成的中心环节[7]，活化的HSC是肝纤维化发生过程中产生细胞外基质(ECM)、促进肝纤维化进展的主要细胞，而α-SMA是HSC活化的特异性标志物，其表达水平的强弱程度与肝纤维化密切相关，已得到公认[8]。本实验也发现，正常对照组α-SMA阳性表达细胞轻微，而模型对照组及利莫那班组α-SMA主要表达于HSC、汇管区和纤维间隔等纤维化发生的前沿部位，但利莫那班组α-SMA阳性表达量较模型对照组显著减少，进一步证实α-SMA表达与肝纤维化发生发展具有密切联系，而经利莫那班干预后的小鼠肝组织α-SMA则表达均明显减弱。Julien等[9]研究证明，利莫那班导致的肝纤维化程度减轻与肌成纤维母细胞(即活化的HSC）凋亡增加和增殖的降低有关，对于CB1基因敲除的小鼠，利莫那班可以抑制肌成纤维样母细胞的增殖。笔者前期通过体外细胞培养方法研究利莫那班对HSC-T6细胞和原代HSC增殖的影响，发现利莫那班可通过抑制细胞外信号调节激酶（ERK）和局部黏着斑激酶（FAK）蛋白磷酸化以及下调CB1 mRNA水平，抑制HSC的增殖和ECM的表达，并且可以促进HSC的凋亡[10]。

总之，大麻素受体系统在肝纤维化发生发展过程中发挥重要作用，CB1的激活可促进肝纤维化的形成。利莫那班作为CB1的阻断剂，通过抑制CB1表达，进而抑制HSC的增殖和激活，并可促进HSC凋亡，最终抑制肝纤维化的发生发展。通过对大麻素受体及其拮抗剂的深入研究,将有助于开发以此为靶点的新型抗肝纤维化药物。

[1] Hezode C,Roudot-Thoraval F,Nguyen S,et al.Daily cannabis smok⁃ing as a risk factor for progression of fibrosis in chonic hepatitis C[J]. Hepatology,2005,42(1):63-71.

[2]Teixeira-Clerc F,Julien B,Grenard P,et al.CB1 cannabinoid recep⁃tor antagonism:a new strategy for the treatment of liver fibrosis[J]. Nat Med,2006,12(6):671-676.

[3]Ishikawa T,Terai S,Urata Y,et al.Administration of fibroblast growth afctor 2 in combination with bone marrow transplantation synergistically improves carbon-tetrachloride-induced liver fibro⁃sis in mice[J].Cell Tissue Res,2007,327(3):463-470.

[4]Zhao XY,Wang BE,Li XM,et al.Newly proposed fibrosis staging cri⁃terion for assessing carbon tetrachloride-and albumin complex-in⁃duced liver fibrosis in rodents[J].Pathol Int,2008,58(9):580-588.

[5]叶立红，王翀奎，刘云燕,等.大麻素受体1在慢性乙型肝炎肝纤维化发生和发展中的作用[J].中华肝脏病杂志，2010，18(9)，706-707.

[6]Hiley CR,Ford WR.Endocannabinoids asmediators in the heart:a potential target for therapy of remodelling after myocardial infarction [J]?Br J Pharmacol,2003,138(7):1183-1184.

[7]Kunos G,Gao B.Endocannabinoids,CB1 recep tors,and liver dis⁃ease:Hittingmore than one bird with the same stone[J].Gastroenter⁃ology,2008,134(2):622-625.

[8]阳丹才让，邓勇，任利，等.硫化氢在大鼠肝星状细胞氧应激中对α-SMA与细胞周期影响的实验研究[J].现代生物医学进展，2010，10（12）：2205-2208.

[9] Julien B,Grenard P,Teixeira-Clerc F,et al.Antifibrogenic role of the cannabinoid receptor CB2 in the liver[J].Gastroenterology, 2005，128(3):742-755.

[10]张建，戴二黑，姜惠卿.内源性大麻素系统对肝硬化的影响[J].世界华人消化杂志，2012，20（13）：1112-1117.