康脑液对局灶性脑缺血再灌注大鼠Pi3k mRNA与Akt mRNA的影响*

肖志娟 赵志敏 邹玉安 薛 茜 邢立强

缺血性脑血管病（ICVD）是中老年人的常见病， 约占全部脑血管病(VCD)的80%，是人类的第三大致死病因。因此，ICVD的防治非常重要。Pi3k/akt通路是体内重要的信号转导通路。1999年Kitagawa等[1]首次报道脑缺血可激活Pi3K/akt信号通路，近年来，不少研究证实Pi3k/akt通路可对脑缺血产生的保护作用[2-3]。本研究制作大鼠脑缺血再灌注模型，观察康脑液对模型大鼠神经功能的影响，探讨其可能作用机制，为临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物。SPF级雄性SD大鼠180只，体质量（270±20）g，购自北京大学医学部动物中心，许可证号：SCXK(京)2011-0012。（2）药品与试剂。尼莫地平：河北永丰药业有限公司生产(国药准字H13021882,规格20 mg)；康脑液：黄芪、丹参、川芎、葛根、钩藤(后下)、三七粉等组成(购于河北北方学院第一附属医院)。三七粉除外，所有药材用冷水浸泡30 min，水位超过药约5 cm为宜。先用武火煮沸，再改用文火慢煎10～20 min，每剂中药共煎煮3次，过滤出药渣，将3次煎煮的药液混匀，文火分别浓缩成400%、200%、100%的康脑液(每mL含生药量4 g、2 g、1 g)，存放于4℃冰箱备用。栓线购自北京沙东生物技术有限公司(产品编号2432-A4)，Pi3k、Akt原位杂交试剂盒购买于武汉博士德公司。（3）主要实验仪器。电脑生物组织包埋机、电脑生物组织摊烤片机(浙江金华科迪)，石蜡切片机、自动脱水机(美国Thermo)，光学显微镜(日本OLYMPUS CX21型)，显微摄影装置(日本NIKON)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药 采用随机数字表法将大鼠随机分为假手术组，模型组，康脑液高、中、低剂量组和尼莫地平组。各组大鼠实验前7 d开始灌胃给药，术后12 h继续给药，每日1次，直至处死。给药剂量按鼠与人体表面积等效剂量折算，康脑液高、中、低剂量组分别为24、12、6 g/(kg·d)，尼莫地平组剂量为1 mg/(kg·d)，假手术组及模型组灌胃等体积蒸馏水。

1.2.2 制备模型 根据改良Longa方法，线栓经右侧颈外动脉插线建立右侧大脑中动脉阻塞(MCAO)法制作大脑缺血再灌注（I/R）模型，假手术组除不穿线外，其余操作同模型组及治疗组。

1.2.3 大鼠神经功能评分 参照Longa建立的神经功能缺损程度的五级四分法评分标准对大鼠进行评分，分别于造模大鼠苏醒时及I/R 24 h后进行评分：0分，不出现神经功能缺损的表现；1分，病灶对侧前爪不能充分伸展；2分，行走时向外侧转圈；3分，行走时向对侧倾斜；4分，不能行走，意识丧失。评分1～3分的大鼠符合模型成功的标准，不符合者剔除。

1.2.4 原位杂交技术检测Pi3k和Akt mRNA 分别于再灌注12、24、48、72、168 h，每组取6只大鼠，10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，经左心室插管至升主动脉，同时剪开右心房，依次灌入生理盐水约200 mL、4%多聚甲醛约200 mL前固定至肢体变硬，开颅取脑，于前囟前2 mm至前囟后3 mm切脑，切块厚度5 mm，迅速置入0.1%DEPC处理的4%多聚甲醛中后固定2～4 h，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片5 μm。用原位杂交方法（按说明操作），检测脑组织Pi3k和Akt mRNA表达。光镜下在梗死周边区随机读取6个互不重叠视野，计数阳性细胞数。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 与模型组比较，康脑液各剂量组、尼莫地平组神经功能评分明显降低(P＜0.05)；与尼莫地平组比较，康脑液高、中剂量组神经功能评分降低(P＜0.05)，见表1。

Table 1 Neurological scores of different times ofcerebral I/R in rats表1 各组I/R大鼠不同时间神经功能评分（n=30，分±s）

Table 1 Neurological scores of different times ofcerebral I/R in rats表1 各组I/R大鼠不同时间神经功能评分（n=30，分±s）

＊＊P＜0.01；a与(2)比较,b与(6)比较,P＜0.05

组别假手术组(1)模型组(2)康脑液高剂量组(3)康脑液中剂量组(4)康脑液低剂量组(5)尼莫地平组(6) F大鼠苏醒时-2.03±0.61 1.47±0.51ab 1.50±0.51ab 1.77±0.43a 1.73±0.45a 6.177＊＊再灌注24 h -2.27±0.52 1.50±0.51ab 1.57±0.50ab 1.93±0.52a 1.87±0.57a 10.338＊＊

2.2 脑组织Pi3k mRNA与Akt mRNA原位杂交结果 见表2、3，图1、2。Pi3k mRNA与Akt mRNA阳性表达可见胞浆呈棕黄色，与假手术组相比，模型组Pi3k mRNA与Akt mRNA表达各时间点明显增高(P＜0.05)。与模型组比较，康脑液各剂量组、尼莫地平组Pi3k mRNA与Akt mRNA的表达各时间点明显增高(P＜0.05)；尼莫地平组Pi3k mRNA与Akt mRNA表达低于康脑液高、中剂量组(P＜0.05)。

Table 2 Comparison of Pi3k mRNA expression level in cerebral tissue between six groups表2 各组大鼠脑组织Pi3k mRNA的比较(n=6，个数/视野，±s)

Table 2 Comparison of Pi3k mRNA expression level in cerebral tissue between six groups表2 各组大鼠脑组织Pi3k mRNA的比较(n=6，个数/视野，±s)

＊＊P＜0.01；a与(1)比较，b与(2)比较，c与(6)比较,P＜0.05，表3同

3.83±0.98 18.17±0.75a 25.67±0.52bc 25.33±0.82bc 22.33±0.52b 22.67±0.82b 714.000＊＊3.33±1.03 21.83±0.75a 29.17±1.33bc 28.83±0.98bc 24.83±0.98b 25.33±0.82b 558.444＊＊组别假手术组(1)模型组(2)康脑液高剂量组(3)康脑液中剂量组(4)康脑液低剂量组(5)尼莫地平组(6) F 48 h 2.83±0.75 18.33±0.52a 31.50±1.22bc 31.67±0.82bc 26.83±0.98b 27.50±0.84b 942.229＊＊72 h 2.17±0.75 16.17±0.41a 40.00±0.63bc 39.83±0.75bc 31.17±1.33b 32.00±1.10b 1712.629＊＊168 h 2.17±0.75 13.83±0.75a 37.17±0.75bc 37.17±0.75bc 30.00±0.63b 30.83±0.75b 1983.459＊＊

Table 3 Comparison of Akt mRNA expression in cerebral tissue between six groups表3 各组大鼠脑组织Akt mRNA的比较(n=6，个数/视野，±s)

Table 3 Comparison of Akt mRNA expression in cerebral tissue between six groups表3 各组大鼠脑组织Akt mRNA的比较(n=6，个数/视野，±s)

组别假手术组(1)模型组(2)康脑液高剂量组(3)康脑液中剂量组(4)康脑液低剂量组(5)尼莫地平组(6) F 12 h 4.00±0.89 13.67±1.21a 27.17±0.75bc 26.67±1.03bc 21.83±1.17b 23.00±0.89b 477.143＊＊24 h 3.67±0.82 17.00±1.26a 32.00±1.10bc 32.00±0.63bc 25.50±0.84b 26.17±0.75b 824.156＊＊组别假手术组(1)模型组(2)康脑液高剂量组(3)康脑液中剂量组(4)康脑液低剂量组(5)尼莫地平组(6) F 48 h 3.50±0.84 20.17±0.75a 36.50±1.05bc 36.67±0.52bc 26.50±0.55b 27.00±0.89b 1 466.107＊＊72 h 3.33±1.03 22.83±0.75a 39.00±0.89bc 38.67±0.82bc 30.00±0.63b 30.33±1.03b 1 382.577＊＊168 h 3.17±0.75 19.33±0.82a 35.83±0.75bc 35.67±0.52bc 28.00±0.63b 28.67±0.82b 1 751.702＊＊

Figure 1 Comparison of Pi3k mRNA expression in cerebral tissue between six groups(In situ hybridization，×400)图1 大鼠脑组织Pi3k mRNA的表达(原位杂交，×400)

Figure 2 Comparison of Akt mRNA expression in cerebral tissue between six groups(In situ hybridization,×400)图2 大鼠脑组织Akt mRNA的表达(原位杂交，×400)

3 讨论

ICVD的发病基础是脑组织缺血而导致相应神经功能缺损，其治疗关键无疑是改善缺血区的血供，促进神经功能恢复。有研究表明保证缺血区血流灌注可加速卒中后突触的可塑性和功能的恢复[4]。临床上超早期行重组组织型纤溶酶原激活剂(r-tPA)溶栓对ICVD的疗效，证实了尽快恢复缺血区的血供，可减轻神经功能的损害。

Pi3k/akt通路是细胞内一条重要的信号转导通路，参与细胞生长、增殖等多种生物学行为的信号转导。Pi3k是磷脂激酶家族中的重要成员，由催化亚单位P110和调节亚单位P85组成异源二聚体，具有脂类激酶活性和蛋白激酶活性。Akt属丝/苏氨酸激酶家族，是Pi3k信号转导途径中一个重要的下游靶激酶，具有丝/苏氨酸激酶活性。生长因子与细胞膜受体结合后激活Pi3k，进而激活下游蛋白如Akt,最终活化和上调cyclinD1，引起细胞增殖[5]。于惠贤等[6]研究表明Pi3k/akt通路的磷酸化参与血管新生，增加脑缺血区微血管密度，从而改善大脑血液循环，达到脑保护的作用。周赛君等[7]研究表明高糖可经上调猴视网膜血管内皮细胞RF/6A细胞内Pi3k/akt信号通路促进血管新生。另外内皮祖细胞的迁移也与Pi3k/akt通路有关[8-9]。且早有研究表明Pi3k/akt通路是促进细胞存活的重要信号转导通路[10]，Pi3k通过3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(PDK1)磷酸化Akt使其活性增强，影响下游凋亡相关蛋白如糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)等,发挥抗凋亡等作用[11]，保护神经元。本研究显示Pi3k/akt通路在I/R大鼠神经功能恢复中起到十分重要的作用。

康脑液由补阳还五汤化裁而来，具有益气活血化瘀、清热平肝、熄风定惊的作用。诸多研究已证实益气活血化瘀通络法治疗脑梗死具有明确疗效[12-13]。本研究结果表明康脑液治疗组，尤其高、中剂量治疗组I/R大鼠的神经功能明显改善。与假手术组相比，模型组Pi3k mRNA与Akt mRNA的表达明显增高，表明缺血影响了Pi3k/akt通路，对脑卒中的恢复起到一定作用，但用药组较模型组更进一步提高了Pi3k mRNA与Akt mRNA的表达，且康脑液高、中剂量治疗组Pi3k mRNA与Akt mRNA的表达明显增高，说明康脑液治疗ICVD的可能机制之一是通过上调Pi3k/akt信号转导通路的表达。

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