内生短短芽胞杆菌011可湿性粉剂的研制

李舒雯， 周金伟， 易有金＊， 柏连阳， 曹 熙

（1．湖南农业大学食品科技学院，长沙 410128；2．湖南农业大学生物安全学院，长沙 410128）

我国每年使用大量的化学农药制剂，容易造成农药残留超标，生物富集，不仅污染生态环境，还影响人类的健康［1－2］。生物农药副作用小、对人无害，是一种具有广阔前景的绿色农药［3］，日益成为全球农药发展的一种趋势［4］。

近年来研究表明，植物内生细菌对许多植物病原生物具有良好的抑制作用［5－8］，内生细菌的研究已成为植物病害生物防治的一个研究热点。本研究从烟草植物组织中分离得到一株内生抗菌细菌011，经鉴定其为短短芽胞杆菌［Brevibacillus brevis（Migula）Shida et al．］，Gen Bank登录号为 DQ444285［9］。011菌不仅对烟草青枯病具有良好的防治效果［9］，而且其发酵滤液还对8种植物病原真菌都有抑制作用，其中对番茄早疫病菌菌丝及孢子均有致畸作用，对番茄早疫病菌最低抑菌浓度MIC为30%，有效抑菌中浓度EC50为9．64%［10］，具有很大的生防开发潜力。

目前常规化学杀菌剂防效低，污染环境，而开发活体微生物可湿性粉剂在现代农药制剂中有广泛的适用范围［11－14］。本研究旨在研制短短芽胞杆菌011可湿性粉剂，确定其制剂成分，为开发高效低毒活体微生物杀菌制剂提供基础，符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治（IPM）的要求。

1 材料与方法

1．1 试验材料

1.1.1 供试菌种

内生短短芽胞杆菌011菌株（Brevibacillus brevis）由湖南省食品科学与生物技术重点实验室分离、鉴定与保存。供试辣椒疫病菌（Phytophthor a capsici Leonian）由湖南农业大学植物病理实验室提供。

1．1．2 培养基

BPY液体培养基、PDA固体培养基［15］。

1．1．3 供试试剂

载体：膨润土、滑石粉、高岭土、硅藻土、白炭黑。

助剂：十二烷基苯磺酸钠（DBS）、聚乙二醇（PEG8000）、吐温－60、木质素磺酸钠、木质素磺酸钙、羧甲基纤维素钠（CMC－Na）。

保护剂：抗坏血酸（VC）、糊精、十二烷基苯磺酸钠（SDS）。

稳定剂：碳酸钙、磷酸氢二钾、羧甲基纤维素钠（CMC－Na）。

1．2 方法

1．2．1 内生短短芽胞杆菌011发酵制备

种子液制备：用接种环挑取斜面保存的011菌株，接入BPY液体培养基中，装液量100 mL／250 mL，初始p H6．8，30℃，摇床180 r／min振荡培养24 h。

发酵培养：将以1%（V／V）接种量接入装液量100 mL／250 mL发酵培养液中，30℃振荡培养60 h，摇床转速为180 r／min。芽胞含量≥4．0×1011，芽胞率≥90%。

1．2．2 检测方法

采用平板菌落计数法，测定制剂的芽胞含量。

按照《中华人民共和国国家标准》对内生菌短短芽胞杆菌011可湿性粉剂进行测定。润湿时间测定参照GB／T 5451－2001，悬浮率测定参照 GB／T 14825－2006，细度测定参照 GB／T 16150－1995，p H 测定参照 GB／T 1601－1993，加速贮存试验按GB／T 19136－2003。

1．2．3 制剂加工工艺

将内生短短芽胞杆菌011摇瓶发酵液与载体按一定比例混合制成母液，鼓风干燥60℃烘干，研磨制成母粉。在母粉中添加一定比例的分散剂、湿润剂、稳定剂等，经喷雾干燥进风温度175℃，出风温度60℃制成可湿性粉剂。

1．2．4 初始制剂成分配比

发酵液70%，载体10%，助剂10%，稳定剂2%，保护剂0．1%，白炭黑补足至100%。

1．2．5 载体的筛选

菌株发酵为液态，选择膨润土、滑石粉、高岭土、硅藻土、白炭黑不同材料做载体，检测均匀母粉的湿润性、重量悬浮率，用平板菌落计数法测定各制剂的芽胞含量，比较各载体制剂松散性、成本等方面因素，选择最优载体。

1．2．6 助剂筛选及复配助剂配比确定

在所制成的母粉中，分别添加10%的助剂，喷雾干燥加工成制剂，测定各制剂的润湿时间，时间越短其润湿性越好；比较各制剂悬浮率的差异，悬浮率越高，分散性越好；测定芽胞含量，根据结果筛选出最佳润湿剂、分散剂。

从助剂中筛选出悬浮性较高，润湿性较好的助剂。按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的质量比经粉碎机混合均匀，喷雾干燥制成可湿性粉剂，测定其悬浮率、润湿时间，选择出复配助剂的最佳质量配比。

1．2．7 稳定剂的筛选

将筛选出的填料、发酵液、湿润剂及分散剂分别与待选稳定剂（2%）混合均匀后喷雾干燥加工成可湿性粉剂，以不加稳定剂的为对照。加速贮藏稳定性：进行热贮（54±2）℃，14 d后测定芽胞存活率。每个处理重复3次。

1．2．8 保护剂的筛选

将筛选出的填料、发酵液、湿润剂及分散剂分别与待选保护剂（0．1%）加工成可湿性粉剂，以不加保护剂为对照，稀释后涂布在平板上，每个处理重复3次，在距离254 n m紫外灯（20 W）40 c m处照射12、24 h后，计算芽胞存活率。

1．2．9 制剂稳定性测定

取100 g内生短短芽胞杆菌011可湿性粉剂置于（4±2）℃和室温（25℃）条件下贮存，每10 d测定样品的芽胞含量，测定11次，确定制剂贮存期间芽胞含量的变化。

2 结果与分析

2．1 载体的筛选

载体在可湿性粉剂中占较大比例，因此载体的润湿性和悬浮率对制剂的润湿性和悬浮率影响大。由表1可知：各制剂的润湿时间均达到国家标准。各载体亲水性较强且表面积大，导致吸水性强。其中滑石粉制剂的湿润时间为10 s。不同材质的载体颗粒不同，故悬浮率有差异。膨润土、硅藻土制剂悬浮率分别为60%、68%，均低于标准，高岭土、滑石粉、白炭黑所制成的制剂悬浮率≥70%，具有较好的悬浮率，适用于本研究制剂的开发。将制备的各制剂于室温（25℃）贮藏14 d后测定活芽胞含量。综合考虑各制剂悬浮率、润湿时间、价格等因素，筛选出最适载体。其中滑石粉制剂，芽胞含量贮存后有2．16×109cf u／g，高于其他载体制剂。

表1 载体对制剂理化性质的影响Table 1 Effects of filler on wettable powder

2．2 助剂筛选

将待选助剂（10%）与已选定的载体、发酵液混合均匀后喷雾干燥加工成可湿性粉剂，测定润湿时间、悬浮率及芽胞含量，筛选出最佳助剂。由表2可知：虽吐温－60润湿时间短，但悬浮率仅为44%；而以CMC－Na为分散剂时，制剂的悬浮率高，但其润湿时间长达293 s。而以木质素磺酸钙为分散剂，其悬浮率高，可达74%，十二烷基苯磺酸钠作为润湿剂，其润湿时间最短，为4 s。因此，选择木质素磺酸钙与十二烷基苯磺酸钠复配，筛选出最佳复配比例。

表2 助剂对制剂理化性质的影响Table 2 Effects of additives on wettable powder

由表3可知：分散剂的含量逐步增加时，其悬浮率升高；而润湿时间来看，随着润湿剂的减少，其润湿时间逐渐增长。当比例为7∶3时，011菌可湿性粉剂悬浮率为81%，润湿时间17 s达到标准，兼顾成本故确定木质素磺酸钙－十二烷基苯磺酸质量比为7∶3。

2．2．1 稳定剂的筛选

稳定剂能在较长时间内稳定制剂的理化性质，还能提高制剂的渗透性，保证制剂在一定时期内芽胞含量稳定。试验结果见表4：在3种稳定剂中，羧甲基纤维素钠作为稳定剂，热贮后芽胞存活率高达54%，而对照芽胞存活率仅为37%。

表4 稳定剂对制剂热贮的影响Table 4 Effects of stabilizer on wettable powder

表5 保护剂对制剂的影响Table 5 Effects of UV protective agenton wettable powder

2．2．2 保护剂的筛选

UV保护剂能将阳光中的大部分紫外辐射吸收掉，将吸收的能量转化为无害的热能散发到空气中，从而保护制剂达到所需要的效果。由表5可知：选用糊精为011菌可湿性粉剂UV保护剂时，紫外照射12、24 h，芽胞存活率均高出VC和SDS，分别达64%、42%，故选糊精为UV保护剂。

2．3 011菌可湿性粉剂稳定性测定

内生短短芽胞杆菌011可湿性粉剂在25℃室温、（4±2）℃下贮存100 d芽胞含量变化见图1。由图1可知，内生短短芽胞杆菌011可湿性粉剂在室温25℃下贮藏芽胞存活率明显低于（4±2）℃温度。011菌在（4±2）℃贮藏100 d，其芽胞存活率可达90%，而在室温贮藏100 d其芽胞存活率仅为72%。因芽胞杆菌在低温处于休眠状态，易于保存。

图1 011菌可湿性粉剂贮藏期芽胞存活率变化Fig．1 Change of spore survival rate in strain 011 wettable powder during storage

2．4 制剂指标

根据对内生短短芽胞杆菌011可湿性粉剂填料、助剂等筛选试验，确定了内生短短芽胞杆菌011可湿性粉剂最佳配方：滑石粉10%，木质素磺酸钙7%，DBS3%，CMC－Na2%，糊精0．1%。按照中华人民共和国农药相关国家标准进行测定，结果显示制备的内生短短芽胞杆菌011可湿性粉剂在25℃室温下芽胞含量为1．8×1010cfu／g，p H6．8，悬浮率76%，润湿时间52 s，细度通过率98%，制剂贮藏100 d存活率达72%。

3 讨论

生防菌的芽胞存活力是决定其最终防效的因素之一［16］，选择适合的载体和助剂时，含芽胞数量成为衡量可湿性粉剂最佳配方的首要因素。因暂无短短芽胞杆菌可湿性粉剂国家标准，参照2013年实施的《中华人民共和国农药行业标准NY／Y2293．2－2012》，枯草芽胞杆菌可湿性粉剂含胞量指标≥1．0×1010cf u／g，研制的短短芽胞杆菌011可湿性粉剂芽胞含量为1．8×1010cf u／g，符合参照枯草芽胞杆菌可湿性粉剂含胞量行业标准。

载体在可湿性粉剂中占有较大比例，因此载体的润湿性和悬浮率对制剂的润湿性和悬浮率有主要影响。本研究表明芽胞在滑石粉载体中含量稳定，吸附量大，故选取滑石粉为制剂载体。李慧［17］等研究表明，滑石粉可以降低外界不良因素对活菌体的损害，还能使菌体吸附于载体上，具有一定的缓释效果，在贮藏期内菌体释放率较高，菌剂中活菌数保持在1010～1011数量级，同时通过电镜观察，片层状的滑石粉为细菌菌株提供了丰富的吸附位点。Jayaraman［18］等将滑石粉用作微生物农药的主要添加剂。助剂不仅可以提高防效，延长货架期，还能降低成本［19］。筛选的羧甲基纤维素钠是一种黏附剂，此类高分子物质，具有黏附作用和使药液黏稠，故有利于芽胞生存，抵抗恶劣环境，又因羧甲基纤维素钠具有吸湿性及分散性，还能提高011菌可湿性粉剂湿润性及分散性，故选羧甲基纤维素钠为稳定剂。

开发活体微生物杀菌剂不仅提高了农作物的经济效益，又能保护生态环境。本研究短短芽胞杆菌011对多种植物病原菌具有很好的抑菌效果，制备的内生短短芽胞杆菌011可湿性粉剂，迄今文献中未见研究报道。为下一步开发短短芽胞杆菌可湿性粉剂的配方筛选奠定了基础。

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