苹果渣发酵过程中游离氨基酸和挥发性香气成分分析

吕春茂，刘 畅，孟宪军，郑 鹏，徐境一

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

苹果渣发酵过程中游离氨基酸和挥发性香气成分分析

吕春茂，刘 畅，孟宪军，郑 鹏，徐境一

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

为提高苹果渣的利用价值，采用固态发酵法发酵苹果渣制备单细胞蛋白，并通过氨基酸自动分析仪及气相色谱-质谱联用技术对苹果渣制备单细胞蛋白的营养及风味进行分析。结果表明：苹果渣发酵前后游离氨基酸含量由3.25 mg/mL增加至15.68 mg/mL，呈味氨基酸含量由2.73 mg/mL增加至11.45 mg/mL，7 种必需氨基酸含量由0.87 mg/mL增加至5.33 mg/mL；苹果渣经过发酵后挥发性香气成分由发酵前的17 种增加到38 种，芳香族化合物的种类及含量有所增加，并新产生了酯类、呋喃类、含氮类化合物；发酵后苹果渣香气浓郁，风味得到显著改善。

苹果渣；固态发酵；游离氨基酸；挥发性香气成分

我国的苹果加工规模是世界上最大的，每年因苹果加工而产生的鲜果渣达100万t[1]，除少量苹果渣被用于生产果胶、柠檬酸、膳食纤维及食用菌培养基质[1]外大部分被废弃，既污染环境又使其中富含的大量有机营养白白浪费。为了提高苹果渣的利用价值，人们利用微生物发酵增加苹果渣中的蛋白质含量[2]。同未发酵的苹果渣相比，发酵苹果渣中富含蛋白质、脂肪、核酸、VC和无机盐[3-4]，有较好的香味和性能，具有较高营养价值[5]。目前，对发酵苹果渣的研究主要集中于菌体蛋白的利用，而发酵苹果渣中氨基酸及产香特性的分析鲜有报道。氨基酸是构成蛋白质的基本单位，其种类及含量直接影响发酵苹果渣的营养价值及风味，而苹果渣发酵后挥发性香气成分也是判断发酵苹果渣风味的重要指标。发酵苹果渣主要的用途是分离制备菌体蛋白，进而生产人造食用蛋白，这对于补充和丰富人类的蛋白质营养具有重要战略意义，其次也可以作为饲料添加剂，促进畜牧业的发展。本实验利用混合菌种发酵寒富苹果渣，采用氨基酸自动分析仪对鲜果渣及发酵苹果渣中游离氨基酸的种类及含量进行测定，并采用气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）[6]联用技术检测发酵前、后苹果渣的挥发性香气成分，用以研究发酵过程对苹果渣营养价值及风味的影响，为更好开发利用发酵苹果渣提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

寒富苹果 沈阳市东陵区深井子金德胜果园。

苹果渣：寒富苹果鲜榨苹果渣，在60 ℃烘干48 h，用粉碎机粉碎，过60 目筛，备用；培养基：苹果渣料水比1∶3（m/m），121 ℃灭菌20 min；菌种：黑曲霉、热带假丝酵母和啤酒酵母，均来自本实验室；菌种活化：将黑曲霉、热带假丝酵母和啤酒酵母进行斜面活化，在马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）固体培养基活化，30 ℃恒温培养72 h；扩大培养：挑取经过活化的菌种，制成菌悬液，黑曲霉在50 mL PDA固体培养基，热带假丝酵母和啤酒酵母在100 mL PDA液体培养基扩大培养，在30 ℃恒温培养72 h。

1.2 仪器与设备

灭菌锅 上海申安医疗器械厂；超净工作台 苏净集团安泰公司；电热干燥培养箱 南京实验仪器厂；L-8800型氨基酸自动分析仪、离心机 日本日立公司；7890A气相色谱仪、5975C质谱仪 美国安捷伦公司；电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；多功能粉碎机永康帅通工具有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵苹果渣的制备

在制备好的苹果渣培养基中，按体积分数5%的接种量接入混合菌种，混合菌种包括黑曲霉、热带假丝酵母和啤酒酵母，按照1∶3∶3（V/V）混合，30 ℃恒温培养4 d。1.3.2 游离氨基酸的测定

1.3.2.1 样品制备

1 g发酵苹果渣，加10 mL蒸馏水，调节pH值为7.5，加质量分数15%的混合酶（木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的质量比为1∶2），55 ℃酶解3 h，8 000 r/min离心20 min，按1∶1（V/V）加入质量分数5%磺基水杨酸，充分振荡，12 000 r/min离心20 min，取上清液5 mL于蒸发皿中蒸干。用10 mL 6 mol/mL盐酸将样品由蒸发皿中转移至水解管内，抽真空、封管，110 ℃水解24 h。冷却、开瓶、过滤、定容至50 mL，取5 mL于蒸发皿中蒸干，冷却后加2.5 mL 0.02 mol/mL盐酸于蒸发皿中将蒸干样溶解，过0.22 μm滤膜后进样。

1.3.2.2 氨基酸分析仪色谱条件

色谱柱：2622C阳离子型交换树脂（4.6 mm× 6.0 mm）；进样量20 μL；柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液流速0.4 mL/min；分析柱柱温50 ℃；泵1泵压9.1×106Pa；茚三酮溶液流速0.35 mL/min；反应柱柱温136 ℃，泵2泵压1.1×106Pa；紫外检测器在脯氨酸440 nm波长处检测，其他氨基酸在570 nm波长处检测。

1.3.3 挥发性香气成分的测定

1.3.3.1 GC-MS样品制备

将发酵完成的苹果渣4 000 r/min离心20 min，上清液用二氯甲烷萃取，将萃取液30 ℃旋转蒸发至2 mL备用。

1.3.3.2 GC-MS条件

GC条件：色谱柱：DB-1701（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；进样口温度280 ℃；升温程序：40 ℃保持5 min，然后以10 ℃/min升至110 ℃，再以5 ℃/min 升至130 ℃，最后以10 ℃/min升至230 ℃保持5 min；载气He；进样量1 μL；分流进样，分流比50∶1。

MS条件：电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量70 eV；溶剂延迟3.00 min；质量扫描范围35.0～400.0 u。

1.3.3.3 数据处理

利用NIST05标准质谱库检索各组分质谱数据，参考文献资料与标准谱图确认各挥发性香气物质的化学组分，按照峰面积归一化法计算出各组分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 游离氨基酸的含量及组成

游离氨基酸的标准图谱、新鲜苹果渣及发酵苹果渣中游离氨基酸图谱分别如图1、2、3所示，新鲜苹果渣及发酵苹果渣中游离氨基酸的测定结果如表1所示。由表1可知，发酵过程增加了苹果渣中游离氨基酸的种类及含量，游离氨基酸含量由3.25 mg/mL增加至15.68 mg/mL。发酵苹果渣中谷氨酸的含量最高达2.53 mg/mL，其次为天冬氨酸、赖氨酸、丙氨酸含量分别为2.4、1.13、1.01 mg/mL，含量较少的氨基酸是半胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸，含量分别为0.21、0.27、0.37 mg/mL。

新鲜苹果渣中除色氨酸以外的其他7 种必需氨基酸的总含量为0.87 mg/mL，发酵苹果渣中7 种必需氨基酸的总含量为5.33 mg/mL，这表明，发酵过程也显著提高了必需氨基酸的含量，使苹果渣更具营养价值。

表1 新鲜苹果渣及发酵苹果渣中游离氨基酸的含量Table 1 Free amino acid contents of apple pomace and fermented apple pomace

氨基酸是食物味道的主要贡献者[7]，其本身会呈现出酸、甜、苦、鲜等各种味道[8]，甜味类氨基酸有甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸[9]，新鲜苹果渣中甜味类氨基酸

总含量为1.07 mg/mL，发酵苹果渣中甜味类氨基酸总含量为3.57 mg/mL；鲜味类氨基酸有谷氨酸和天冬氨酸[9]，新鲜苹果渣中鲜味氨基酸总含量为1.28 mg/mL，发酵苹果渣中鲜味氨基酸总含量为4.93 mg/mL；呈苦味氨基酸有酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸[10]，新鲜苹果渣中苦味氨基酸总含量为0.38 mg/mL，发酵苹果渣中苦味氨基酸总含量为2.95 mg/mL。这些呈味氨基酸的含量由2.73 mg/mL增加到11.45 mg/mL。发酵苹果渣中含量较高的呈味氨基酸分别为谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸，因此可认为以上3 种氨基酸为发酵苹果渣的特征性风味物质。

图1 游离氨基酸标准图谱Fig.1 Standard spectrum of free amino acids

图2 新鲜苹果渣中游离氨基酸测定图谱Fig.2 Spectrum of free amino acids in apple pomace

图3 发酵苹果渣中游离氨基酸测定图谱Fig.3 Spectrum of free amino acids in fermented apple pomace

2.2 GC-MS联用技术检测挥发性香气成分

图4和图5为苹果渣发酵前和发酵后GC-MS总离子流量图，分析鉴定结果见表2。其中发酵前苹果渣的挥发性香气成分共17 种，包括醇类1 种、醛类2 种、酸类2 种、芳香族7 种和烷烃类5 种，其相对含量分别为4.02%、6.49%、6.4%、2.7%和2.24%；苹果渣发酵后鉴定出38种挥发性香气成分，包括醇类1种、醛类1种、酸类1种、酯类7种、芳香族10种、烷烃类9种、含氮化合物5种、呋喃类3种、噻吩类1种，其相对含量分别为6.55%、1.48%、1.4%、2.42%、10.94%、4.85%、67.56%、3.37%和0.36%。

通过分析苹果渣发酵前后挥发性香气成分的种类及含量，发现苹果渣发酵后酸类物质种类及相对含量均减少，乙酸、己酸转化成了其他香气成分，对苹果渣的风味影响较小；发酵后新产生了7 种酯类物质且乙酸乙酯的相对含量最高，达到总量的1.36%，而乙酸乙酯是具有较强水果气味的酯类成分[11]，因此乙酸乙酯对苹果渣发酵后风味的增强具有重要贡献；苹果渣发酵后产生了3 种呋喃类物质，分别是丁内酯、糠醇、1-（2-呋喃）-1,2-乙二醇，前2 种物质具有甜香、焦糖香、面包香、咖啡香及坚果香味[12-14]，且香味持久，因此丁内酯、糠醇也是苹果渣发酵制品重要的特征风味物质；苹果渣发酵后较发酵前芳香类物质的种类及含量都有所增加，其中变化明显的为苯乙醇、苯甲醇、苯甲醛、苯乙酮，而苯乙醇是应用较为广泛的一种食用香料，具有柔和、愉快而持久的玫瑰香气[15]及新鲜的面包和清甜的蜂蜜香气[16]，苯甲醇具有花香气味[17]，苯

甲醛具有坚果香气[14]，苯乙酮具有坚果及水果香气[16]，因此上述芳香类物质也是发酵苹果渣香气浓郁重要的特征风味物质。

发酵过程产生5 种含氮化合物，分别为吲哚、十六酰胺、顺-9-十八碳烯酰胺、十五烷腈、齐墩果腈，其中吲哚具有粪臭和动物气息[16]，但其含量较低，所以它的存在不会使发酵苹果渣产生令人不愉快的霉臭气味。顺-9-十八碳烯酰胺相对含量为38.96%，是所检测出香气成分中含量最高的，其次是齐墩果腈，相对含量达23.46%。顺-9-十八碳烯酰胺在红象牙芒果[18]中检测到，齐墩果腈在松茸[19]及蚕蛹[20]中检测到，但目前还没有在发酵苹果渣中鉴定到顺-9-十八碳烯酰胺及齐墩果腈的相关报道，并且没有对这2 种物质香气特征的描述，因此，顺-9-十八碳烯酰胺及齐墩果腈对发酵苹果渣气味产生的作用还有待进一步研究。

表2 发酵苹果渣产生主要香气成分Table 2 Volatile aroma components of fermented apple pomace

图4 未发酵苹果渣GC-MS总离子流量图Fig.4 GC-MS total ionic chromatogram of aroma components of unfermented apple pomace

图5 发酵苹果渣GC-MS总离子流量图Fig.5 GC-MS total ionic chromatogram of aroma components of fermented apple pomace

3 结 论

发酵苹果渣中总游离氨基、必需氨基酸及呈味氨基酸的种类及含量较高，均显著高于未发酵苹果渣氨基酸的种类及含量，增加了苹果渣的营养价值。发酵过程有效地提高了苹果渣香气浓度及香味种类，苹果渣的风味得到明显改善。

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Analysis of Free Amino Acids and Aroma Components in Fermented Apple Pomace

LÜ Chun-mao, LIU Chang, MENG Xian-jun, ZHENG Peng, XU Jing-yi
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

The contents and kinds of free amino acids (FAAs) in apple pomace and fermented apple pomace were determined by amino acid analyzer. The aroma components in the unfermented and fermented samples were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Results showed that the content of FAAs was increased from 3.25 to 15.68 mg/mL, and the content of flavor amino acids was increased from 2.73 to 11.45 mg/mL after fermentation. Fermented apple pomace contained 7 essential amino acids and their total content was increased from 0.87 to 5.33 mg/mL. Seventeen and thirty eight volatile compounds were identified in the unfermented and fermented apple pomace, respectively. The types and contents of aromatic substances were increased. In the fermented apple pomace, esters, furans, and nitrogen-containing substances were produced. Fermentation improved the flavor of apple pomace.

apple pomace; fermention; free amino acids; volatile aroma components

TS255.36

A

1002-6630（2014）18-0146-05

10.7506/spkx1002-6630-201418029

2013-12-28

沈阳市大型仪器共享项目（4130199-1102-01083909001）

吕春茂（1970—），男，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：bt_lcm@126.com