花椒挥发油的提取工艺优化及抗肿瘤活性分析

韩胜男，李 妍，张晓杭，蒋建兰*

（天津大学化工学院，天津 300072）

花椒挥发油的提取工艺优化及抗肿瘤活性分析

韩胜男，李 妍，张晓杭，蒋建兰*

（天津大学化工学院，天津 300072）

采用水蒸气蒸馏法提取花椒中的挥发油，以得油率为评价指标，以料液比、冷浸时间和提取时间为考察因素，通过星点设计-响应面法优选花椒挥发油提取工艺。结果表明：花椒挥发油水蒸气蒸馏提取的最佳工艺条件为料液比1∶12（g/mL）、冷浸时间2.5 h、提取时间4.7 h，得油率可达9.284%。采用MTT法检测花椒挥发油的体外抗肿瘤活性，测得花椒挥发油对HeLa、A549、K562 三种细胞的IC50值分别为（11.2±0.2）、（6.26±0.05）、（1.37±0.03） mg/mL。表明花椒挥发油具有较强的体外抗肿瘤活性，且对3种肿瘤细胞的生长均有抑制作用。

花椒；挥发油；水蒸气蒸馏提取；抗肿瘤

花椒，又称秦椒、川椒或山椒，为芸香科花椒属植物青椒（青花椒）（Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.）或花椒（红花椒）（Zanthoxylum bungeaum Maxim.）的干燥成熟果皮[1]，原产于我国，是一种传统的药食两用食物。花椒具有独特浓烈香气，是一种重要的调味品，也可作为香料香精原料[2]；同时，花椒性温，归脾、胃、肾经，具有温中散寒、除湿、杀虫、止痛等功效[3-5]。花椒中含有多种化学成分，其主要成分为挥发油。现代研究表明花椒挥发油含有多种活性成分且具有抗菌、杀虫等多种药理活性[6-8]，具有广阔的开发应用前景[9-10]。目前，花椒挥发油提取已有微波、超临界等多种方法的研究报道[11-13]，关于花椒挥 发油的研究多集中于成分分析以及抗菌、杀虫等药理活性 研究[14-16]。臧林泉等[17]采用SRB方法对花椒挥发油进行抗人A549肺癌杀伤及诱导凋亡试验，结果表明高浓度花椒挥发油对其有杀伤作用，低浓度挥发油对其有诱导凋亡作用。Paik等[18]研究发现花椒挥发油可通过促进活性氧含量杀伤人HepG2肝癌细胞。尽管，近年来研究表明花椒挥发油具有抗肿瘤活性[17-18]，但报道尚少。本研究采用水蒸气蒸馏法进行花椒挥发油提取，操作简单方便，节约成本，制 得挥发油杂质含量少，通过星点设计-响应面法对提取条件进行优化，提高挥发油得油率，同时采用MTT法检查挥发油对人宫颈癌HeLa细胞、人肺癌A549细胞和人红白血病K562细胞3 种不同细胞的体外抗肿瘤活性，为花椒挥发油的进一步开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花椒购于安国市新东方药业有限责任公司，产地陕西，剔除枝叶和花椒籽，50 ℃烘干1 h，粉碎过40目筛，备用。

Na2SO4（分析纯） 天津江天化工技术有限公司；RPMI1640培养基、胰蛋白酶、青霉素、链霉素 美国生命技术公司；胎牛血清 北京鼎国生药技术有限责任公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美国Sigma公司；依托泊苷（批号：09090731） 江苏恒瑞医药股份有限公司；HeLa细胞、A549细胞、K562细胞均由武警医学院生药与药剂学教研室提供。

1.2 仪器与设备

JD100-3电子天平 沈阳龙腾电子有限公司；NAPCO5420-1型CO2培养箱 美国Napco公司；JJT-900/1300型超净工作台 北京半导体设备一厂；Model 680型酶标仪 美国伯乐生命医学公司；Olympus1×70倒置显微镜 日本Olympus公司；Adventurer万分之一电子天平 美国Ohaus公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒挥发油提取工艺

准确称取花椒粉末100 g，冷水浸泡一定时间后，转移至2 000 mL圆底烧瓶，加一定量水用挥发油提取器提取一定时间。收集精油部分，缓慢加入适量Na2SO4干燥，除去Na2SO4，得挥发油称质量，按式（1）计算得油率[19]：

1.3.2 最佳提取工艺优化

根据相关文献资料[20-22]及预实验，选取影响提取工艺的主要因素料液比（A）、冷浸时间（B）、提取时间（C）作为考察因素，以花椒挥发油得油率为响应值，进行星点设计-响应面法。因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.3.3 花椒挥发油体外抗肿瘤活性测定

1.3.3.1 样品制备及细胞培养

取最佳提取工艺条件下制备的花椒挥发油适量，加入DMSO溶解，用RPMI1640无血清培养液稀释成250、25、2.5、0.25、0.025 mg/mL；HeLa细胞、A549细胞、K562细胞细胞株分别培养于RPMI1640培养基中，内含体积分数10%的胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素，置37 ℃、5% CO2培养箱中常规 培养。

1.3.3.2 MTT法检测抗肿瘤活性

采用MTT法，检测花椒挥发油分别对人宫颈癌HeLa细胞、A549肺癌细胞、白血病K562细胞3 种癌细胞的生长抑制作用[23]。取对数生长期的各细胞分别接种于96孔板中，调整细胞密度为4×104个/mL，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱内培养24 h后给药。药物处理组每孔加入不同质量浓度的花椒挥发油溶液100 μL，使终质量浓度分别为125、1 2.5、1.25、0.125、0.0125 mg/mL，另设阳性对照组（加入不同浓度的依托泊苷100 μL）、阴性对照组（加入溶剂100 μL）和空白对照组（加入培养基100 μL）。每组均设4 个复孔。培养48 h后弃去培养液每孔加入MTT溶液（1 mg/mL）50 μL，37 ℃培养4 h，离心弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，轻度振荡10 min。酶标仪测定490 nm波长处各孔光密度（optical density，OD）值，计算药物对细胞的生长抑制率，计算公式为：

样品平行制备2 份，每份样品重复实验3 次。依据待测药物不同剂量下的细胞抑制率，用GraphPad软件计算药物半数抑制质量浓度（IC50）值。

2 结果与分析

2.1 花椒挥发油提取工艺优化

2.1.1 数学回归模型的建立及方差分析

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

响应面试验设计与结果见表2。利用Design-Expert 8.0.5b软件对试验结果进行回归分析，得到花椒挥

发油得油率与料液比、冷浸时间、提取时间3 个因素之间的编码值回归模型：得油率Y=8.871+0.139A+0.349B+ 0.605C+0.117AB-0.304AC+0.045 8BC-0.518A2-0.382B2-0.433C2。

表3 回归模型方差分析结果Table 3 ANOVA results for the fitted regression model

对拟合的方程进行方差分析，结果见表3。由表3可知，模型P=0.010 5＜0.05，表明回归模型显著；失拟项P=0.260 6＞0.05，差异不显著，说明未知因素对试验结果干扰小，残差均由随机误差引起；回归方程的相关系数R2=0.800 2，说明模型拟合程度良好。因素C、交互项AC及二次项A2对花椒挥发油得油率有显著影响（P＜0.05），其余项不显著，表明各因素对挥发油得油率的影响不是简单的线性关系。

2.1.2 工艺条件优化及预测

图1 料液比、冷浸时间和提取时间对挥发油得油率的响应面图Fig.1 Response surface plots showing the effects of solid to liquid ratio, soaking time and extraction time on the yield of essential oil

根据回归模型方程，将料液比（A）、冷浸 时间（B）、提取时间（C）对花椒挥发油得油率的影响绘制成响应面图（图1）。由图1可知，提取时间对挥发油得油率影响最显著，表现为曲线最陡，料液比次之，冷浸时间的影响最小。根据回归方程及响应面，得到最佳提取条件：料液比1∶11.95（g/mL）、冷浸时间2.5 h、提取时间4.74 h。考虑到实际操作的方便性，将最佳提取条件修正为料液比1∶12（g/mL）、冷浸时间2.5 h、提取时间4.7 h。在此条件下，平行提取花椒挥发油3 次，得到的实际得油率为9.284%，与理论预测值9.178%接近，说明该回归方程能较真实地反映各因素对花椒挥发油得油率的影响，可用于花椒挥发油提取工艺的优化。

2.2 花椒挥发油体外抗肿瘤活性

花椒挥发油对HeLa细胞、A549细胞和K562细胞的生长均表现出一定的抑制作用。花椒挥发油及阳性对照组对各细胞的IC50值计算结果见表4。本实验采用依托泊苷为阳性对照组，依托泊苷是常用的抗肿瘤药物，现已被广泛应用于癌症的化疗方案。由表4可知，花椒挥发油对K562细胞生长抑制作用较强，对HeLa细胞生长抑制作用相对较弱。与阳性对照组对比可知，花椒挥发油对A549细胞和K562细胞的IC50值偏小、对HeLa细胞的IC50值偏大，表明其对A549细胞和K562细胞的抑制作用略优于阳性对照药物，对HeLa细胞的抑制作用则偏差。总体说明，花椒挥发油具有良好的抗肿瘤作用，且对多种不同肿瘤细胞均有抑制作用。

表4 花椒挥发油对肿瘤细胞的IC50值Table 4 IC50of the essential oil for three cancer cell lines

表4 花椒挥发油对肿瘤细胞的IC50值Table 4 IC50of the essential oil for three cancer cell lines

细胞系花椒挥发油IC50/（mg/mL）阳性对照组IC50/（mg/mL）HeLa11.2±0.24.39±0.03 A5496.26±0.059.02±0.05 K5621.37±0.034.79±0.06

3 结 论

影响花椒挥发油提取的因素主要有料液比、冷浸时间、提取时间，通过采用星点设计-响应面法对花椒挥发

油水蒸气提取的工艺条件进行优化，建立了花椒挥发油得油率与料液比、冷浸时间、提取时间之间关系的二次多项式回归方程，该模型准确有效，确定了提取花椒挥发油的最佳工艺条件，即料液比1∶12（g/mL）、冷浸时间2.5 h、提取时间4.7 h，得油率可达9.284%。在体外抗肿瘤活性实验中，采用MTT法检测了花椒挥发油对HeLa细胞、A549细胞和K562细胞的生长抑制活性，结果表明花椒挥发油对这3 种肿瘤细胞的生长均表现出一定的抑制作用，通过与阳性对照药物进行对比，表明花椒挥发油具有良好的体外抗肿瘤作用。本研究为花椒的深入开发利用提供了参考，其抗肿瘤活性成分及作用机制还需进一步探讨。

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Extraction and Antitumor Activity of Essential Oil from Zanthoxylum bungeanum Seeds

HAN Sheng-nan, LI Yan, ZHANG Xiao-hang, JIANG Jian-lan*
(School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

Response surface methodology was used to optimiz e the steam distillation extraction of essential oil from Zanthoxylum bungeanum seeds. The yield of essential oil was investigated with respect to solid-to-solvent ratio, cold water soaking time and extraction time. The optimum extraction conditions were determined as follows: solid-to-solvent ratio 1:12 (g/mL), cold water soaking time 2.5 h and extraction time 4.7 h, leading to an extraction yield of 9.284%. MTT assay was used to detect the antitumor activity of the essential oil. Its 50% inhibition concentration (IC50) for HeLa, A549 and K562 cells were (11.2±0.2), (6.26±0.05) and (1.37±0.03) mg/mL, respectively, suggesting potent antitumor activity in vitro and inhibitory effect on various cancer cells.

Zanthoxylum bungeanum; essential oil; steam distillation; antitumor activity

R284

A

1002-6630（2014）18-0013-04

10.7506/spkx1002-6630-201418003

2013-12-17

国家自然科学基金青年科学基金项目（81102900）

韩胜男（1989—），女，硕士，研究方向为中药现代化工程。E-mail：lingnanshengxue@163.com

*通信作者：蒋建兰（1972—），女，副教授，博士，研究方向为中药现代化工程。E-mail：jljiang@tju.edu.cn