响应面法优化超临界抗溶剂法制备姜黄素-PLGA复合颗粒

忻 娜，Fatemeh ZABIHI，贾竞夫，姜丽萍，赵亚平,*

（1.上海交通大学化学化工学院，上海 200240；2.西安航天复合材料研究所，陕西 西安 710025）

响应面法优化超临界抗溶剂法制备姜黄素-PLGA复合颗粒

忻 娜1，Fatemeh ZABIHI1，贾竞夫1，姜丽萍2，赵亚平1,*

（1.上海交通大学化学化工学院，上海 200240；2.西安航天复合材料研究所，陕西 西安 710025）

采用超临界二氧化碳抗溶剂法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物（curcumin-encapsulated poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA）包埋姜黄素的纳米颗粒。以姜黄素包埋率为优化指标，利用响应面试验设计方法，系统考察芯材比、PLGA溶液流速、超声功率3 个因素对PLGA包埋姜黄素的影响。结果表明：当PLGA与姜黄素质量比3∶1、PLGA溶液流速1.8 mL/min、超声功率180 W时，包埋率达到93.89%。姜黄素-PLGA颗粒平均粒径为90 nm，粒径分布窄。

姜黄素；超临界二氧化碳；聚乳酸-羟基乙酸共聚物；包埋率；纳米颗粒；响应面法

姜黄素是从姜科植物姜黄等的根茎中提取得到的活性成分，具有抗炎、抗氧化、调节免疫、保护内脏、抗纤维化、抗癌等作用，可用于健康食品和药品的活性成分[1-8]。但姜黄素水溶性低，吸收差，而且见光易分解，影响了其生物利用度[9]。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（curcumin encapsulates poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA）是生物可降解高分子聚合物，具有良好的生物相容性，已用于制备药物的缓释材料[10]。采用PLGA包埋姜黄素，可以提高其生物利用度，并防止姜黄素的分解[11-17]。但是，目前制备PLGA包埋姜黄素的方法存在包埋率低、收率低、溶剂残留高等缺点。超临界CO2抗溶剂法是一种制备超细粒子的有效方法，因为操作条件温和，产品中残留溶剂低，非常适于活性物超细颗粒的制备[18-25]。抗溶剂，即对某种溶液体系中的溶质溶解度很低，而对溶剂溶解度很高的物质，加入体系后会改变溶剂对溶质的溶解度，导致溶质析出。为此，本研究以PLGA和姜黄素分别作为壁材和芯材，采用超临界CO2抗溶剂法制备姜黄素-PLGA复合纳米颗粒，考察PLGA溶液流速、超声功率和PLGA与姜黄素质量比对包埋率的影响，采用响应面分析法获得了最高包埋率的工艺条件，对其光照稳定性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

姜黄素（纯度＞99%） 国药集团化学试剂有限公司；聚乳酸羟基乙酸共聚物（LA/GA=75/25，纯度＞99%，特性黏度0.5 dL/g） 山东医疗器械研究所；二氧化碳（纯度＞99%） 上海交通大学气体供应站；乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SP-756型紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；Spectrum100傅里叶变换红外光谱仪美国珀金埃尔默股份有限公司；D/max-220/PCXX射线衍射仪 日本理学株式会社；Hitachi S-3400型扫描电子显微镜 日立集团株式会社；ZS-90型纳米粒度仪 英国马尔文仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 复合物制备工艺路线

实验装置如图1所示。主要由超临界二氧化碳输送系统、溶液注入系统和配有超声波装置的高压沉淀釜组成。在实验时，设置好沉淀釜反应温度，并将8 mL姜黄素乙醇溶液（5 g/L）放入其中，然后用高压泵将CO2打入沉淀釜中，在设定的温度和压强下，溶液中姜黄素快速析出形成颗粒，打开超声装置，使姜黄素更为均匀地分布在釜中；待姜黄素完全析出后，用高压泵将PLGA二氯甲烷溶液打入沉淀釜中，此时，以姜黄素为成核中心，PLGA快速在其表面析出，形成包覆物。当PLGA溶液打入结束后，继续打入CO210 min，将残留溶剂带出釜内，在实验过程中，釜内CO2与溶剂物质的量比值为120。

图1 实验装置示意图Fig.1 Schematic diagram of the apparatus used to prepare curcumin-loaded PLGA nanoparticles

1.3.2 单因素试验

根据前期研究，固定温度35 ℃、压强9 MPa，研究PLGA与姜黄素质量比、PLGA溶液流速和超声功率对包埋率的影响，确定各因素的最佳范围。

1.3.3 响应面试验

在单因素试验基础上，选取PLGA与姜黄素质量比、PLGA溶液流速与超声功率3 个因素作为响应面试验因素，以产品的包埋率为响应值，进行三因素三水平的响应面分析试验，优化工艺条件。

1.3.4 样品分析及表征

1.3.4.1 姜黄素包埋率测定

乙醇能溶解姜黄素，而不溶解PLGA，因此用乙醇清洗附在样品表面的姜黄素。取一定量的姜黄素微胶囊样品于5 mL离心管中，加入乙醇，剧烈振荡5 min，以10 000 r/min转速离心，取上清液用紫外-可见分光光度计测定其吸光度，离心管里的样品继续以相同条件清洗，反复数次，直至洗出液中姜黄素含量减少趋势明显变缓，将每次上清液中测得的姜黄素合计为样品中表面吸附的姜黄素量， 用乙酸乙酯溶解样品得出样品中剩余姜黄素量。姜黄素包埋率的计算公式如下所示：

1.3.4.2 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）表征

将少量样品分散在蒸馏水中，然后将分散液滴于载玻片上，待蒸馏水蒸发后，将载玻片用导电胶粘于电子显微镜SEM样品台表面，在真空状态下喷金2 min，然后进行测试。

1.3.4.3 傅里叶变换红外光谱 （Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析

称取样品约1 mg，与100 mg溴化钾碾磨混合均匀压成薄片后，进行测试分析。

将样品填满样品台凹槽内，置于X射线衍射仪进行扫描分析，扫描电压40 kV，电流30 mA，扫描角度10°～60°，速率10°/min。

1.3.4.5 动态光散射分析

称取样品5 mg，用20 mL去离子水分散，超声1 min，用纳米粒度仪测定粒径大小。

1.3.4.6 姜黄素-PLGA光照稳定性分析

将未包埋的姜黄素原料（空白对照）与包埋的样品放入离心管中，密封，自然光照射5 h，然后分别检测两个样品中的姜黄素含量与初始含量之比。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

如图2A所示，当PLGA溶液流速2.5 mL/min、超声功率180 W时，芯材比对包埋率有显著影响。PLGA与姜黄素质量比增加，姜黄素包埋率相应增加。这是由于原料中PLGA量增加，析出的PLGA量也相应增加，有利于对姜黄素的包埋。

学校对教师的考核标准主要是学生的书面考试成绩，而最快提高学生成绩的方法，就是教师通过实验的演示和讲解，让学生强行记忆、背诵考点。教师主动让学生做实验的机会很少，并且演示实验的过程往往又被严重压缩，导致了做实验不如讲实验、背实验，而实验不像理论，必须通过明确的步骤演示才能得以实现，加深学生对理论的理解。

如图2B所示，当芯材比2∶1、超声功率180 W时，姜黄素包埋率随着PLGA溶液流速的增加先增大后减少。这可能是因为随着PLGA溶液流速的增加，溶液通过喷嘴进入釜内时的剪切力增大，对二氧化碳体系的搅动越大，加快了溶剂与抗溶剂之间的传质速率，传质效果增强，PLGA颗粒瞬间成核的数量增加，包埋效果增强；但当流速大于2.5 mL/min并继续增加时，生成的PLGA颗粒粒径逐渐变小，包封能力有所下降，导致包埋率的降低。

如图2C所示，当芯材比2∶1、PLGA溶液流速2.5 mL/min时，姜黄素包埋率随着超声功率的增加先增大后减少，这可能是因为超声功率增加，溶剂与抗溶剂的传质速率及传质效果增强，PLGA颗粒瞬间成核的数量增加，包埋效果增强，但随着超声功率的进一步增加，生成的PLGA颗粒粒径逐渐变小，包封能力有所下降，导致包埋率的降低。

图2 芯材比（A）、PLGA溶液流速（B）和超声功率（C）对姜黄素包埋率的影响Fig.2 Effect of PLGA/curcumin ratio, solution flow rateand ultrasonic power on the embedding rate of curcumin

2.2 响应面试验

在单因素试验基础上，选取PLGA与姜黄素质量比、PLGA溶液流速与超声功率3 个因素作为响应面试验因素，以产品的包埋率为响应值，固定压强9 MPa、温度35 ℃，各个因素的水平选择范围为PLGA/姜黄素1∶1～3∶1、PLGA溶液流速1.5～3.5 mL/min，超声功率120～240 W，响应面各因素及水平如表1所示。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface design

利用Design-Expert 8.05软件设计三因素三水平的响应面试验，响应面试验设计和结果见表2。

表2 响应面试验设计方案及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 响应面二次模型回归和方差分析Table 3 Variance analysis for the fitted regression equation

由表3可知，模型P值小于0.000 1，差异极显著，即回归效果极显著。方程的决定系数R2=0.977 6，表明该模型拟合程度良好。条件参数交互作用对包埋率的影响如图3所示，由图3和表3可知，在所选取的3 个因素中，PLGA与姜黄素质量比对包埋率的影响最大，超声功率次之，溶液流速的影响最小。通过Design-Expert 8.05软件拟合多元回归方程如下所示：

根据回归方程，由Design-Expert 8.05软件模拟出试验的最优条件为：PLGA与姜黄素质量比3∶1、PLGA溶液流速1.79 mL/min、超声功率185.62 W，在此条件下，姜黄素包埋率可达95.13%。考虑到实际操作性，将条件参数修正为PLGA与姜黄素质量比3∶1、PLGA溶液流速1.8 mL/min、超声功率180 W，在修正后的条件参数下进行验证实验，姜黄素的包埋率93.89%，与软件优化结果基本相符，故采用响应面分析法优化得到的条件参数准确可靠，具有较高实用价值。

图3 条件参数交互作用对包埋率的影响Fig.3 Response surface plots for the interactive effects of three conditions on the embedding rate of curcumin

由表2可知，本实验制备的姜黄素-PLGA纳米粒包埋率普遍在80%以上，最优条件下包埋率更是高达93.89%，这是由于本实验建立的新工艺，先将姜黄素在沉淀釜中成核析出，并可作为PLGA的异相成核中心，在超声波分散均匀高效传质的作用下，PLGA在姜黄素颗粒上析出并对其有效包埋从而获得到高包埋率的结果。

2.3 姜黄素-PLGA复合颗粒形貌结构特征

2.3.1 SEM及粒径图

图4 姜黄素-PLGA复合颗粒SEM（A）和粒径分布（B）图Fig.4 Scanning electron microscopic (SEM) image and particle size distribution of curcumin-loaded PLGA nanoparticles

随机选取表2中试验1 2号获得样品（反应条件为PLGA与姜黄素质量比1∶1、PLGA溶液流速1.5 mL/min、超声功率180 W）的SEM图与粒径大小分布图如图4所示。由图4A可见，姜黄素-PLGA复合颗粒粒径在50～100 nm之间，粒径分布均匀，基本呈球形，颗粒之间稍有团聚。纳米粒度分析仪对样品的测试结果如图4B所示，样品的平均粒径在90 nm左右，粒径分布窄。2.3.2 FTIR特点

图5 FTIR图Fig.5 FTIR images

姜黄素、PLGA原料和姜黄素-PLGA复合纳米粒红外光谱如图5所示。由图5A和5B可知，PLGA在3 100～2 800 cm-1和1 900～1 700 cm-1处有很强的红外吸收峰，姜黄素在1 600～1 400 cm-1处有很强的吸收峰。但是姜黄素-PLGA复合颗粒（图5C）在上述3 个区域均出现特征峰，并且峰形和峰位置没有偏移，说明制备过程对姜黄素和PLGA结构没有产生明显影响，同时，也说明姜黄素-PLGA复合纳米粒的确由姜黄素和PLGA组成。

2.3.3 XRD分析

为了分析比较姜黄素在PLGA的分布形式，将姜黄素与PLGA进行常规的物理混合，分别测试了将姜黄素、PLGA、姜黄素/PLGA复合颗粒和姜黄素与PLGA物理混合的样品的XRD。姜黄素（图6A）在2θ为10°～30°有强的衍射峰，PLGA微球（图6B）没有特别明显的衍射峰，只有一个宽峰。对比图6C和图6D则可以看出，姜黄素-PLGA复合纳米粒与姜黄素和PLGA物理混合颗粒在10°～30°姜黄素的特征衍射峰都有所减弱，说明PLGA对姜黄素晶体的衍射存在一定的影响，制备的姜黄素-PLGA复合颗粒衍射峰的削弱比物理混合的要大很多，说明姜黄素被包埋在PLGA中。

图6 XRD图Fig.6 XRD images

2.3.4 样品的耐光性

选取表2中试验3号的样品作为测试对象，并以姜黄素原料为对照，经过5 h日光暴晒后，原料姜黄素含量降低为62%，而复合颗粒PLGA中姜黄素保留率为98%。说明PLGA包埋的姜黄素耐光性大大优于姜黄素原料，包埋姜黄素对光照的抵抗能力增加，姜黄素不易被分解。

3 结 论

本实验采用超临界抗溶剂法成功制备了高包埋率的姜黄素-PLGA复合纳米颗粒。研究了单因素对包埋率的影响，采用响应面优化设计法，以包埋率为优化指标，系统考察PLGA与姜黄素质量比、PLGA溶液流速、超声功率对PLGA包埋姜黄素的影响。结果表明，在所选取的3 个因素中，PLGA与姜黄素质量比对包埋率的影响最大，超声功率次之，PLGA溶液流速的影响最小。当PLGA与姜黄素质量比3∶1、PLGA溶液流速1.8 mL/min、超声功率180 W时，包埋率达到最大值93.89%。所制备的姜黄素-PLGA复合纳米粒平均粒径为90 nm，粒径均匀分布；相对于姜黄素原料，姜黄素-PLGA复合颗粒的耐光稳定性大大提高。

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Optimizing Supercritical Anti-solvent Preparation of Curcumin-Loaded PLGA Nanoparticles by Response Surface Methodology

XIN Na1, Fatemeh ZABIHI1, JIA Jing-fu1, JIANG Li-ping2, ZHAO Ya-ping1,*
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; 2. Xi’an Aerospace Composite Materials Institute, Xi’an 710025, China)

Curcumin-encapsulated poly (lactic-co-glycolic acid)(PLGA) nanoparticles was prepared using supercritical carbon dioxide antisolvent assisted with ultrasound and the preparation process was optimized by response surface methodology. The effects of the mass ratio of curcumin to PLGA, the flow rate of solution, and ultrasonic power on properties of curcumin-encapsulated PLGA nanoparticles were investigated. The optimal conditions were determined as follows: the mass ratio, 3:1; the flow rate, 1.8 mL/min; and the ultrasonic power, 180 W. Under these conditions, the embedding rate reached 93.89%, and the average particle size was about 90 nm with a narrow distribution.

curcumin; supercritical CO2; PLGA; embedding rate; nanoparticle; response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201418001

2013-12-31

国家自然科学基金面上项目（20976103）；中国博士后科学基金项目（2013M541521）

忻娜（1989—），女，硕士研究生，研究方向为超临界流体技术制备功能性食品。E-mail：xinna@sjtu.edu.cn

*通信作者：赵亚平（1962—），男，教授，博士，研究方向为超临界流体技术中的化学化工过程、功能性食品。

E-mail：ypzhao@sjtu.edu.cn

O625.4

A

1002-6630（2014）18-0001-05