大孔树脂富集发酵大豆提取物中乙酰胆碱酯酶抑制剂的工艺研究

杨宜非，刘亚琼，曹婉宁

（河北农业大学食品科技学院，河北保定071000）

大孔树脂富集发酵大豆提取物中乙酰胆碱酯酶抑制剂的工艺研究

杨宜非，刘亚琼*，曹婉宁

（河北农业大学食品科技学院，河北保定071000）

为了确定适宜的大孔树脂型号及富集乙酰胆碱酯酶抑制剂的最佳工艺条件，通过静态吸附率和解吸液抑制率的测定，确定较优树脂型号，并考察动态解吸的相关影响因素。实验结果表明：ADS-17为富集乙酰胆碱酯酶抑制剂的适宜树脂，其静态吸附率和解吸液抑制率分别可达96.65%、64.24%，其适宜富集工艺条件：静态吸附饱和的树脂用80%乙醇溶液进行动态解吸，洗脱速度为1.0mL/min时，解吸液AChE抑制率为62.64%。

发酵大豆，大孔树脂，乙酰胆碱酯酶抑制剂，富集

阿尔兹海默症（Alzheimer’s Disease，AD）是一种神经系统退行性疾病，据统计，2010年全世界AD患者达3560万人[1]。目前，临床上主要以乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）抑制剂作为其治疗手段。发酵豆制品在我国及周边国家有着悠久的加工和食用历史。近年来，科学研究表明，发酵大豆不仅具有抗氧化[2]、降血压[3]、降血糖[4]、溶血栓等作用，还具有抗老年痴呆的作用[5]，但发挥作用的生理活性物质尚不明析。因此，探索发酵大豆中乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究对于拓宽发酵大豆制品的利用价值和范围具有重要的理论意义和实用价值。

近年来，大孔吸附树脂分离纯化技术以其条件温和、设备简单、操作简易等优点被广泛应用于天然产物有效成分的提取分离、中药新药的研发与生产中，诸如黄酮类、皂苷类、生物碱类等植物活性成分的分离纯化[6-8]，中药复方精制，生物化学物质的净化、分离，工业废水、废液的处理等方面。本文以大孔吸附树脂为手段，考察其对发酵大豆中乙酰胆碱酯酶抑制剂的分离富集效果，为该抑制剂活性成分的纯化及鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小黑豆 购于河北省保定市三丰粮油市场（2011年秋季收获，吉林产），发酵后真空冷冻干燥，磨粉备用；大孔树脂型号：D101、AB-8、HPD100、HPD417、HPD600、HPD750、HPD950、ADS-17、ADS-7、NKA-2

购于沧州宝恩吸附材料科技有限公司；乙酰胆碱酯酶、硫代乙酰胆碱碘化物、5，5’-二硫代-2，2’-二硝基苯甲酸（DTNB） Sigma-A ldrich；其他试剂 均为国产分析纯。

iMark酶标仪 日本Bio-Rad Laboratories公司；MS-1微孔板振荡器 Shimadzu，Japan；1.0cm×35cm玻璃层析柱 保定市明发生物科技有限公司；SHZ-82数显恒温恒速振荡器 金坛市晶玻实验仪器厂；BT100F智能型蠕动泵 保定雷弗流体科技有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 大孔树脂的预处理 将10种大孔树脂分别用95%乙醇浸泡24h，使其充分溶胀后去除乙醇及漂浮物，再用95%乙醇反复冲洗至流出液加等量水不变白色浑浊为止，放掉乙醇液，用蒸馏水反复冲洗至滤液无醇味即可。各型号树脂主要性能指标见表1所示。

1.2.2 样液的制备 小黑豆发酵冻干粉用80%乙醇超声处理后减压浓缩得浸膏，然后用乙酸乙酯萃取并减压浓缩得样品浸膏，加少量甲醇和水溶解作为上样液。

1.2.3 乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定 采用Ellman光度检测法[9]并加以改进。

抑制率（%）=（K阳性对照-K样品）/（K阳性对照-K阴性对照）×100

1.2.4 大孔树脂的静态吸附率和解吸液抑制率测定 分别准确称取0.5g预处理好的10种树脂于碘量瓶中，各加入10m L浓度为0.5mg/m L的上样液，室温下置于振荡器，速度为120r/m in，吸附24h，测定滤液对乙酰胆碱酯酶的抑制率。将抽滤后的树脂放回碘量瓶中，加入80%的乙醇10m L，置于振荡器上，速度保持120r/min，进行24h静态解吸，测定解吸液对乙酰胆碱酯酶的抑制率。

由于是未知物质，因此不能用吸附量表示吸附能力的强弱，但通过测定吸附前后溶液对酶的抑制率可以比较不同树脂对抑制剂的吸附强弱，吸附性越强相应地吸附率越高；另外，通过测定解吸液对酶的抑制率可以表示物质从大孔树脂上解吸下来的情况，如果解吸抑制率越大，表明物质解吸下来的越多，由于乙醇对该酶也有一定的抑制，因此需扣除解吸溶剂的影响，若采用解吸率（%）=I解/（I前-I后）×100考察不同树脂的解吸情况，则对于吸附情况不好的树脂，由于分母值较小，会产生解吸率偏大的情况，此外也不能扣除溶剂的影响。因此，按下式计算大孔树脂的吸附率和解吸液抑制率：

吸附率（%）=（I前-I后）/I前×100

解吸液抑制率（%）=（I解-IE）×100

式中：I前为吸附前上样液对乙酰胆碱酯酶的抑制率；I后为吸附24h后滤液对乙酰胆碱酯酶的抑制率；I解为解吸24h后滤液对乙酰胆碱酯酶的抑制率；IE为解吸所用乙醇溶液对乙酰胆碱酯酶的抑制率。

1.2.5 大孔树脂静态吸附动力学曲线和静态解吸动力学曲线 称取按1.2.4筛选到经预处理的树脂各2.5g于碘量瓶中，加入浓度为0.5mg/m L的上样液50m L，置于振荡器中，速度为120r/m in，测定不同吸附时间滤液对乙酰胆碱酯酶的抑制率，计算吸附率，并绘制静态吸附动力学曲线。

将筛选到的树脂按上述方法吸附饱和后用去离子水冲洗若干次，抽滤，然后分别加入50m L 80%乙醇溶液进行解吸，测定解吸0.5、1、1.5、2、24h时解吸液对乙酰胆碱酯酶的抑制率，并绘制树脂的静态解吸动力学曲线。

1.2.6 不同乙醇浓度洗脱对解吸液抑制率的影响 称取按1.2.5筛选得到的经预处理的树脂5份各0.5g，加入浓度为0.5mg/m L的上样液10m L，置于振荡器中，速度为120r/m in，使其静态吸附饱和，之后用去离子水冲洗若干次，抽滤，然后每份加入浓度分别为20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液各10m L进行解吸洗脱。解吸24h后，测定各解吸液对乙酰胆碱酯酶的抑制率，确定适宜的乙醇洗脱浓度。

1.2.7 大孔树脂动态梯度解吸对解吸液抑制率的影响 目的是考察动态洗脱时解吸液浓度对解吸效果的影响。称取按1.2.5筛选得到的经预处理的树脂12.0g于1000m L大三角瓶中，加入浓度为0.5mg/m L的上样液240m L，按上述方法进行静态吸附饱和，之后用去离子水冲洗若干次，抽滤，加入去离子水进行湿法装柱，用相当于3倍柱体积的去离子过柱平衡后，用20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱速度为0.5m L/min，每5m L收集一次流份，每个乙醇浓度的洗脱液收集8个流份，测定每个流份的乙酰胆碱酯酶抑制率，计算出解吸液的抑制率，绘制ADS-17树脂的动态梯度解吸曲线。

1.2.8 大孔树脂动态洗脱速度对解吸液抑制率的影响 称取按1.2.5筛选得到的经预处理的树脂12.0g四份，分别置于1000m L大三角瓶中，加入浓度为0.5mg/m L的上样液240m L，按上述方法进行静态吸附饱和，湿法装柱并平衡后，先用20%乙醇溶液洗脱50m L，再用80%乙醇溶液进行洗脱，以去除极性成分并顺利过渡到高浓度洗脱液，洗脱速度分别为0.3、0.5、1.0和1.5m L/m in，洗脱过程中每5m L收集一次流份，测定各流份的乙酰胆碱酯酶抑制率，计算出解吸液的抑制率，绘制ADS-17树脂的动态洗脱曲线，确定适宜的洗脱速度。

表1 大孔树脂的物理性能Table 1 Physical properties of 12macroporous resins

1.3 数据统计与分析

应用SPSS 17.0软件中的Duncan单因素方差分析进行数据处理与分析，差异显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂静态吸附率与解吸液抑制率

10种大孔吸附树脂的静态吸附率与解吸液抑制率如表2所示。

表2 大孔树脂吸附率与解吸液抑制率Table 2 The rate ofmacroporous resin’s adsorption and desorption fluid inhibition

由表2可知，D101、AB-8、ADS-17、ADS-7吸附率均在90%以上，明显高于其他型号树脂；但ADS-7树脂的解吸液抑制率较低（＜50%），后续对D101、AB-8、ADS-17这三种树脂进行进一步筛选。

2.2 D101、AB-8、ADS-17大孔树脂静态吸附动力学曲线和静态解吸动力学曲线

三种大孔树脂的静态吸附速率曲线和静态解吸动力学曲线如图1、图2所示。由图1可知，三种大孔树脂的吸附率随时间延长而增大，当达到2.5h后趋于平缓。各树脂吸附率相当，AB-8在2.5h前吸附速率稍快，吸附24h时D101和ADS-17的吸附率均大于95%。

由图2可知，在解吸0.5h之内，三种树脂基本解吸完毕，随时间延长，D101和ADS-17大孔树脂的解吸液抑制率基本不变，且ADS-17大孔树脂的解吸液抑制率显著高于其他两种型号的树脂（p＜0.05）。综上所述，ADS-17大孔树脂为富集发酵大豆中AChE抑制剂的适宜树脂。

图1 D101、AB-8和ADS-17树脂的静态吸附动力学曲线Fig.1 Static adsorption curves of D101，AB-8 and ADS-17

2.3 乙醇浓度对ADS-17大孔树脂解吸液抑制率的影响

乙醇浓度对解吸液抑制率的影响如图3所示，随着乙醇浓度的增加，解吸液抑制率呈上升趋势，当乙醇浓度为80%时，ADS-17大孔树脂的解吸液抑制率显著高于其他乙醇浓度解吸液的抑制率（p＜0.05），因此，选择80%乙醇溶液作为洗脱液。

图3 乙醇浓度对解吸液抑制率的影响Fig.3 Effectof ethanol concentration on the rate ofdesorption fluid inhibition

2.4 ADS-17大孔树脂梯度解吸对解吸液抑制率的影响

由图4可知，动态解吸时，解吸液的抑制率随着乙醇浓度的增加呈上升趋势，当乙醇浓度为20%～ 40%时（即解吸液体积≤80m L时），解吸液的抑制率较低，当乙醇浓度为60%～80%时（即80m L＜解吸液体积≤160m L时），解吸液抑制率迅速上升，接近70%；当乙醇浓度为95%时（即解吸液体积＞160m L时），解吸液抑制率呈下降趋势。因此60%～80%乙醇溶液为较适宜的解吸液浓度。

2.5 ADS-17大孔树脂动态解吸时不同洗脱流速对解吸液抑制率的影响

动态解吸时不同洗脱流速对解吸液抑制率的影响如图5所示。随着洗脱液流速的增加，解吸液抑制率呈增大趋势，洗脱流速为1.0m L/min时，解吸液抑制率最高，当洗脱流速为1.5m L/m in时，测得解吸液最大抑制率为51.93%。因此，动态解吸时洗脱液流速为1.0m L/m in时，洗脱效果较好，此时解吸液抑制率最高为62.64%。

图4 ADS-17大孔树脂动态梯度解吸对解吸液抑制率的影响Fig.4 Effectof differentethanol on the rate of desorption fluid inhibition in dynamic desorption of ADS-17macroporous resin

图5 不同洗脱流速对解吸液抑制率的影响Fig.5 Effect of differentelution flow rate on the rate of desorption fluid inhibition in dynamic desorption analysis

3 结论

3.1 通过比较10种不同型号的大孔树脂的静态吸附率和解吸液的抑制率，结合静态吸附曲线和解吸曲线，ADS-17型大孔树脂适用于发酵大豆乙酸乙酯萃取物中乙酰胆碱酯酶抑制剂的富集。当对ADS-17型大孔树脂静态解吸时，选择80%乙醇溶液作为洗脱液，其解吸液的抑制率较高，为64.24%。

3.2 利用ADS-17型大孔树脂动态解吸时，当洗脱液为80%乙醇溶液，洗脱速度为1.0m L/m in时，富集到的乙酰胆碱酯酶抑制剂浓度较高，此时洗脱液的AChE抑制率最大可达62.64%。

[1]World Alzheimer Report 2012：Overcoming the stigma of dementia[EB/OL].URL http：//www.alz.co.uk/research/World Alzheimer Report2 012.pdf.Accessed 10.07.13.

[2]Wang D，Wang L J，Zhu F X，et al.In vitro and in vivo studies on the antioxidant activities of the aqueous extracts of Douchi（a traditional Chinese salt-fermented soybean food）[J]. Food Chemistry，2008，107（4）：1421-1428.

[3]Zhang J H，Tatsumi E，Ding C H，et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides in douchi，a Chinese traditional fermented soybean product[J].Food Chemistry，2006，98（3）：551-557.

[4]Chen J，Cheng Y Q，Yamaki K，et al.Anti-α-glucosidase activity of Chinese traditionally fermented soybean（douchi）[J]. Food Chemistry，2007，103（4）：1091-1096.

[5]Liu Y Q，Wang L J，Cheng Y Q，et al.Isoflavone content and Anti-acetylcholin esterase activity in commercial douchi（a traditional Chinese salt-fermented soybean food）[J].Japan Agricultural Research Quarterly，2009，43（4）：301-307.

[6]徐清萍，何培新，朱广存.大孔树脂分离怀菊花黄酮的研究[J].食品工业科技，2011，32（4）：103-106.

[7]熊春华，李大方，姚彩萍，等.大孔吸附树脂吸附染料木素的研究[J].中国食品学报，2007，7（6）：71-76.

[8]李娜，鲁晓翔.大孔吸附树脂分离纯化红花总黄酮的研究[J].食品工业科技，2011，32（4）：276-279.

[9]Ellman G L，Courteney K D，Valentino A J，et al.A new and rapid colorimeteric determination of acetylcholineesterase activity [J].Biochemical Pharmacology，1961，7（2）：88-90.

Study on enrichment of acetylcholinesterase inhibitor from fermented soybean w ith macroreticular resin

YANG Yi-fei，LIU Ya-qiong*，CAOW an-ning
（College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，China）

To determ ine the app rop riate type of mac roporous resin and op timum conditions of enriching acetylcholinesterase inhibitors.Op timum type of resin was determ ined bymeasuring the rate of static adsorp tion and desorp tion fluid inhibition，and the dynam ic desorp tion’s related factors was stud ied.Results indicated that ADS-17 was the suitab le resin on enriching acetylcholinesterase inhibitors，and the rate of static adsorp tion and desorp tion fluid inhibition could reach 96.65%，64.24%.The op timum enrichment conditions were as follows：macroreticular resin by static adsorp tion saturation，elution solvent of 80%ethanol，elution rate of 1.0m L/m in. Under the mentioned conditions，the desorp tion fluid AChE inhibition rate reached 62.64%.

fermented soybean；macroreticular resin；acetylcholinesterase inhibitor；enrichment

TS214.9

B

1002-0306（2014）18-0232-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.042

2013－11－11 *通讯联系人

杨宜非（1990-），男，硕士研究生，研究方向：食品科学与工程。

国家自然科学基金青年科学基金项目（31101336）。