高产胞外多糖干酪乳杆菌的太空诱变选育

李雄超，张卫兵，*，梁　琪，李学朋，张　炎，宋雪梅

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.甘肃省功能乳品工程实验室，甘肃兰州730070）

高产胞外多糖干酪乳杆菌的太空诱变选育

李雄超1，2，张卫兵1，2，*，梁琪1，2，李学朋1，2，张炎1，2，宋雪梅1，2

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.甘肃省功能乳品工程实验室，甘肃兰州730070）

为了提高干酪乳杆菌G5的胞外多糖产生能力，采用太空诱变技术对其进行选育，从中筛选出高产胞外多糖菌株。通过富集培养、平板筛选、脱脂乳发酵和遗传稳定性实验，最终得到两株高产胞外多糖且遗传稳定性较好的突变株EPS-33和EPS-43。突变株EPS-33和EPS-43在25℃发酵脱脂乳，发酵结束时胞外多糖的产量分别220.42和198.49mg/L，为出发菌株的1.9倍和1.7倍。2个突变菌株与出发菌株产胞外多糖的变化趋势基本相同，但产量大幅增加。

太空诱变，干酪乳杆菌，胞外多糖

胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）是由微型藻类或细菌在生长过程中分泌到细胞外的一类糖类化学物。已报道的产胞外多糖细菌有乳酸菌、肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。乳酸菌产生的胞外多糖有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的进入培养基形成粘液，称为粘液多糖，这两者都属于次级代谢产物，分子量一般在4.0×104～6.0×106u之间[1-3]。乳酸菌产生的胞外多糖可赋予食品特殊的口感和风味，增强食品的稳定性和持水性，可作为食品添加剂被广泛地运用在食品加工中。并且胞外多糖还具有促进肠道菌群生长、增强免疫活性、抗肿瘤及降低结肠癌发病率等多种功能，可应用于医药领域[4-5]。

太空诱变技术是利用卫星、飞船等返回式航天器将菌株搭载到宇宙空间中，在微重力、高真空、强辐射、交变磁场、超净环境等太空诱变因子的作用下使菌株的遗传性状发生改变[6]的相对常规的物理或化学诱变技术，太空诱变技术具有诱变率高、诱变多向、育种周期短等特点。近年来，太空诱变技术在微生物育种方面得到了越来越广泛的应用，通过太空诱变技术得到许多性状优良的菌株，其中包括可高效利用木糖生产L-乳酸的乳酸菌、高产山梨糖的生黑醋酸杆菌、高产泰乐菌素的弗氏链霉菌等[7-9]。

本研究以本实验室筛选的干酪乳杆菌G5[10]为出发菌株，利用太空诱变技术对其进行诱变处理，以期获得高产胞外多糖的突变株。

1　材料与方法

1.1材料与设备

菌粉干酪乳杆菌冻干成菌粉后搭载神州八号飞船进行太空诱变；脱脂乳粉购自完达山乳业股份有限公司。

YQX-II型厌氧培养箱上海跃进医疗器械有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司；PHS-3C型数显酸度计杭州雷磁仪器分析厂；754PC型紫外可见分光光度计上海光谱仪器有限公司；Yx-280A型手提式压力蒸汽灭菌器合肥华奉医疗设备有限公司；BP121S型电子天平德国赛多利斯集团；LVDV-1型粘度计上海万磁仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1实验流程出发菌株→冻干粉→太空诱变→复水→富集培养→平板筛选→脱脂乳发酵→高产突变株筛选→遗传稳定性实验→产胞外多糖曲线。

1.2.2培养基MRS固体培养基[11]：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，K2HPO42g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温-80 1m L，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，琼脂15g，蒸馏水1L，调节pH至6.2～6.4，121℃灭菌20m in。

MRS液体培养基：培养基成分同固体培养基，不加琼脂。

脱脂乳发酵培养基[11]：脱脂乳粉9g，蒸馏水100m L，115℃灭菌15m in。调节pH至6.8～7.0。

1.2.3富集培养将5m L无菌生理盐水加入经太空诱变的冻干菌粉，充分溶解后取1m L菌液接入10m L MRS液体培养基中，25℃厌氧培养48h。连续进行3次富集培养后，放入4℃冰箱保存备用。

1.2.4平板筛选取1m L富集培养液用无菌生理盐水进行梯度稀释，选择合适稀释倍数的菌液涂布在MRS平板上，25℃厌氧培养24h后观察菌落形态特征。用无菌牙签接触菌落，轻轻挑起并垂直离开，观察菌落在培养基表面的拉丝情况[12-14]。挑选粘性菌落进行MRS平板划线分离，25℃厌氧培养24h后将转接入MRS斜面培养基，25℃厌氧培养24h，待长好后4℃保存备用。

1.2.5发酵性能测定挑取一环斜面菌种接入10m L脱脂乳发酵培养基中，25℃厌氧培养，连续活化3次。活化后的菌株按3%（V/V）的接种量接种到150m L脱脂乳发酵培养基中，25℃厌氧培养，记录其凝乳时间和凝乳状态。发酵结束后测定粘度和滴定酸度[11]。

1.2.6胞外多糖的提取精确量取10m L发酵乳，沸水浴加热30min后，10000r/min、4℃离心5min，去除沉淀，向上清液中加入1m L 15%TCA后充分搅拌，静置30m in后10000r/m in、4℃离心15m in，去除沉淀后取上清液，用NaOH溶液调节pH为8，然后于10000r/m in、4℃离心15m in，去除沉淀后取上清液，向其中按1∶5（V/V）加入无水乙醇，使乙醇的浓度大于80%，4℃静置12h；然后于15000r/m in、4℃离心30m in，弃去上清液，取沉淀用无水乙醇洗涤；将洗涤过的沉淀用10m L蒸馏水溶解，蒸馏水透析48h，每4h换一次水[15]。透析后用蒸馏水定容到100m L待用。

1.2.7胞外多糖产量的测定胞外多糖产量的测定使用苯酚硫酸法[15-17]，用葡萄糖做标准曲线。

标准曲线的绘制：精确称取105℃干燥至恒重的葡萄糖1.00g，置于1000m L容量瓶中，蒸馏水定容。再分别吸取5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0m L加入100m L容量瓶中定容，蒸馏水做空白对照。吸取标准溶液1m L，于室温下向其中加入5%苯酚1m L并摇匀，再快速向其中加入5m L浓硫酸。待反应结束溶液冷却至室温时，用紫外分光光度计于490nm处测其吸光度。空白样以1m L蒸馏水按照同样的步骤进行。

取1m L样液，于室温下向其中加入5%苯酚1m L并摇匀，再快速向其中加入5m L浓硫酸。待反应结束溶液冷却至室温时，用紫外分光光度计于490nm处测定吸光度，根据下式计算样品中胞外多糖含量：

式中：C—胞外多糖含量，单位为毫克每升（mg·L-1）；100—表示样品定容到100m L；10—表示发酵乳样品体积为10m L；A—样品在490nm处的吸光度。

1.2.8遗传稳定性实验将筛选出来的高产胞外多糖菌株按3%（V/V）的接种量，接种到脱脂乳发酵培养基中，连续传代培养15代，测定其第1～15代的胞外多糖产量，考察菌株产胞外多糖的遗传稳定性。

1.2.9发酵时间对胞外多糖产量的影响将筛选出来的高产胞外多糖菌株与出发菌株以3%（V/V）的接种量，分别接种到脱脂乳发酵培养基中，25℃厌氧培养，每1h测定一次胞外多糖含量，考察发酵时间对胞外多糖产量的影响。

1.3数据处理

采用SPSS 13.0软件对实验数据进行分析处理。

2　结果与分析

2.1平板筛选结果

经太空诱变的菌株富集培养后用MRS平板分离，部分菌株在MRS平板上的菌落形态特征如表1所示。

从表1可以看出，在太空诱变前，菌株表面无光泽，菌落呈隆起状。经过太空诱变后，部分菌株菌落变为表面有光泽，菌落扁平，菌落边缘光滑平整。出发菌株没有出现拉丝，为非粘菌落；诱变后部分菌株呈现出拉丝状，为粘丝菌落，可根据菌落的这一特性对高产胞外多糖的菌株进行初筛。从中共筛选出44株菌进行后续实验。

2.2发酵性能测定

将筛选得到的44株菌进行脱脂乳发酵实验，记录各菌株的发酵时间，并观察其凝乳状态，结果如表2所示。

从表2可以看出，相比出发菌株G5，大部分突变株的发酵时间保持不变，仅有EPS-1、EPS-17、EPS-40三株菌发酵时间变长。大部分突变株的滴定酸度保持不变，滴定酸度在81～85°T范围内，少部分突变株如EPS-10、EPS-43的滴定酸度略有提升，达到89°T。大部分突变株发酵乳的组织结构状态相比出发菌株G5有所改善，粘度都有所提高。其中菌株EPS-19、EPS-33和EPS-43在25℃发酵乳粘度较高，分别为2.704、3.271、2.947Pa/s。这是因为菌株产生的胞外多糖可起到增稠剂或胶凝剂的作用，从而会增加发酵乳的粘度[16]。

表1　乳酸菌菌落特征及粘丝性能Table 1　Colony characteristic and sticky silk performance of Lactic acid bacteria

表2　菌株的发酵性能Table 2　Performance of strains

2.3胞外多糖产量的测定

将得到的发酵乳采用热处理、TCA处理、碱沉淀、乙醇溶解和透析处理去除其中的蛋白质和小分子糖成分，再测定其中的胞外多糖含量，各菌株胞外多糖的产量如表3所示。

表3　菌株胞外多糖的产量Table 3　Exopolysaccharides production of strains

从表3中可以看出，突变菌株EPS-19、EPS-33和EPS-43具有较高的产胞外多糖的能力。菌株EPS-19、EPS-33和EPS-43的胞外多糖产量分别为180.56、220.42、198.49mg/L。相比而言，出发菌株G5的胞外多糖产量为116.38mg/L，突变菌株EPS-19、EPS-33和 EPS-43的产胞外多糖能力分别为出发菌株G5的1.6、1.9和1.7倍。

2.4遗传稳定性实验

将胞外多糖产量较高的菌株EPS-19、EPS-33和EPS-43连续培养15代，测定其第1～15代的胞外多糖产量，结果见图1。

从图1可以看出，随着传代次数的增加，菌株EPS-33的胞外多糖产量稳定在215.61～224.98mg/L之间，菌株EPS-43的胞外多糖产量稳定在196.43～ 204.72mg/L之间，二者胞外多糖产量基本保持不变。菌株EPS-19的胞外多糖产量随着传代次数的增加而逐渐减少，第15代时，其胞外多糖产量仅为132.41mg/L，所以突变菌株EPS-19的高产胞外多糖性能不具有遗传稳定性。因此选择菌株EPS-33和EPS-43作为高产胞外多糖的菌株。

图1　突变菌株的遗传稳定性Fig.1　Genetic stability ofmutant strains

2.5发酵时间对胞外多糖产量的影响

将出发菌株、突变菌株EPS-33和EPS-43以3%（V/V）的接种量，分别接种到脱脂乳发酵培养基中，每隔1h测定胞外多糖含量，直至发酵结束。脱脂乳发酵期间，EPS-33和EPS-43胞外多糖产量随发酵时间延长的变化情况如图2所示。

图2　胞外多糖产量随发酵时间的变化曲线Fig.2　The curve of exopolysaccharides production alongwith the fermentation time

从图2可以看出，三个菌株产胞外多糖的变化趋势基本相同，在脱脂乳发酵前6h，三个菌株的胞外多糖产量均较低。出发菌株G5胞外多糖产量在7h时开始快速增加，14h后增长速度逐渐放缓。菌株EPS-33和EPS-43的胞外多糖产量在6h开始迅速增加，16h后增长速度逐渐放缓。菌株G5胞外多糖产量在发酵结束时最高，达到116.38mg/L；菌株EPS-33和EPS-43的胞外多糖产量在发酵结束时也达到最高，分别为220.42、198.49mg/L。

3　结论

采用太空诱变育种技术对一株干酪乳杆菌G5进行诱变，通过富集培养、平板筛选、脱脂乳发酵实验、遗传稳定性实验，筛选得到多株形态特征和发酵性能变化的突变株，其中突变菌株EPS-33和EPS-43在25℃下发酵脱脂乳，胞外多糖产量分别可以达到220.42、198.49mg/L，为出发菌株G5的1.9倍和1.7倍。2个突变菌株与出发菌株产胞外多糖的变化趋势基本相同，但产量大幅增加，说明太空诱变对干酪乳杆菌胞外多糖产量的提高效果显著。本研究可为太空诱变在乳酸菌选育中的应用和乳酸菌胞外多糖的生产奠定基础。

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Mutation of Lactobacillus casei with high production of exopolysaccharides by space mutagenesis

LIXiong-chao1，2，ZHANGWei-bing1，2，*，LIANG Qi1，2，LIXue-peng1，2，ZHANG Yan1，2，SONG Xue-mei1，2
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Functional Dairy Engineering Laboratory of Gansu Province，Lanzhou 730070，China）

A starting strain of Lactobacillus casei G5 was mutated by space mutagenesis technology to screen strains w ith high p roduction of exopolysaccharides.Through enrichment culture，p late screening，skim m ilk fermentation and genetic stability experiment，we finally got two stab le mutant strains EPS-33 and EPS-43 w ith high p roduction of exopolysaccharides.while mutant strains EPS-33 and EPS-43 fermented in skim m ilk at 25℃，the yield of exopolysaccharides were 220.42mg/L and 198.49mg/L，which were 1.9 and 1.7 times of starting strain.Exopolysaccharides p roduc tion of the two mutant strains had the same change trend as starting strain，but the twomutant strains had a significant increase in p roduction.

space mutagenesis；Lac tobacillus casei；exopolysaccharides

TS201.3

A

1002-0306（2014）18-0185-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.031

2013－12－18*通讯联系人

李雄超（1989－），男，硕士研究生，研究方向：乳品微生物。

国家农业科技成果转化资金项目（2012GB2G100461）；“十二五”农村领域国家科技计划项目（2011AA100903）；兰州市科技创新人才团队培育计划项目（2011-1-144）；教育部“新世纪优秀人才支持计划”项目（NCET-10-0015）。