食源性活性肽制备与分离纯化的研究进展

葛平珍，周才琼

（西南大学食品科学学院暨重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆400716）

食源性活性肽制备与分离纯化的研究进展

葛平珍，周才琼*

（西南大学食品科学学院暨重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆400716）

近年来，食源性生物活性肽在功能食品中的应用越来越广，从而使其成为食品领域研究的热点问题。本文对酶解法、微生物发酵法及人工合成法制备食源性性生物活性肽进行简单介绍，根据食源性活性肽分子量及其所带电荷，对食源性活性肽的分离纯化进行重点概述。

食源性活性肽，制备，分离纯化

长期生理失衡及接触外在有毒物质的人，正常的生理功能会受到影响从而引发各种健康问题。食品中有特定功效的营养性成分与非营养性成分对抑制人体某些疾病的出现有一定的作用。因此，在抑制疾病或维持最佳健康状态方面，功能食品常作为化学疗法的佐剂或替代物[1]。近年来，研究证明食源性活性肽对机体的主要系统（消化系统、心血管系统、神经系统、免疫系统）有一定的保护效用，将具有某特定功能的生物活性肽作为功效成分制备功能食品或直接将活性肽制备成药品，这些功能食品或药品对控制或预防疾病有一定的作用[2]。某些食品加工过程能浓缩活性多肽，这些活性肽不仅在营养上可作为必需氨基酸的来源[3]，也能在一定程度上改善人体的多种机能，如阿片样物质的活性、结合矿物质、免疫调节活性、抗氧化活性、抗菌活性、抗血栓、降血脂及降血压等。

1 食源性生物活性肽概述

食源性生物活性肽是蛋白质经特定蛋白水解酶酶解或发酵后形成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称。用于制备活性肽的动植物原料主要包括未充分利用的蛋白质丰富的食物和富含蛋白质的工业副产物，或者蛋白质中含有特定药理价值的多肽序列或氨基酸残基[3]。根据制备活性肽的食物来源进行简要分类。

动物源活性肽，即动物蛋白通过特定水解酶作用而降解为对人体健康有益的片段。用来制备活性多肽的动物蛋白主要有牛奶蛋白（酪蛋白和乳清蛋白）、鸡蛋和肉制品中的蛋白质、海洋生物蛋白（鱼类、大型藻类等）[3]。以牛奶中的蛋白质为原料，可得到酪蛋白磷酸肽（CaseinPhosphopeptides）、免疫调节酪蛋白肽（Immunomodulating casein peptides）、抗血栓形成肽（Antithromboticpeptides）、抗菌肽（Antimicrobial peptides）、ACE抑制肽（Angiotensinconverting enzyme（ACE）inhibitory peptides）及抗氧化肽（Antioxidant peptides）[4]。

植物源活性肽是植物蛋白通过水解酶酶解或发酵形成的对人体有益的肽段。豆类（扁豆、黄豆等）、谷类（燕麦、小麦、玉米等）、麻类植物的种子和油菜籽[3]等植物中的蛋白质能用于制备生物活性肽。大豆水解物中分离的ACE抑制肽能够抑制ACE活性，从而降低血压。以玉米蛋白作为原料，经不同的处理过程能得到抗氧化肽、降压肽、抗肿瘤肽等不同功能肽，朱艳华等证明玉米多肽具有保护小鼠肝脏线粒体氧化损伤及红细胞氧化损伤的功效[5]。

2 食源性活性肽的制备方法

食物原料不同，生物活性肽的制备方法也有一定差异。一般是将食物原料中的蛋白质经特定蛋白酶酶解或微生物发酵制备活性肽，可通过物理方法（加热、剧烈振荡、超声波破碎等）将蛋白质变成短肽，也可通过化学方法将氨基酸合成目标肽链。在此主要介绍酶水解法和微生物发酵法制备活性多肽。

2.1 酶水解法

该法的关键是选择合适的酶和酶解条件。蛋白水解酶根据来源不同可分为三类：a.动物蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等。b.植物蛋白酶如无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶及菠萝蛋白酶等；c.微生物蛋白酶如细菌胶原酶、嗜热菌蛋白酶等。每种酶都有其专一切割位点，不同底物选用不同的混合酶，能将蛋白质切割成不同肽段[6]。多种动植物源性生物活性肽均能有酶水解法制备，但此处只各举两例简要说明酶水解法生产活性肽（表1）。

表1 酶水解法生产活性肽Table.1 Enzymatic hydrolysis to produce active peptide

2.2 微生物发酵法

微生物发酵法是利用微生物自身的胞外蛋白酶将蛋白质降解的过程。例如，乳酸菌发酵将牛奶蛋白水解，水解产物中分离出活性多肽[11]，包括血管紧张素转化酶抑制肽（Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides）、抗血栓肽（Antithrombotic peptides）酪蛋白磷酸肽（Casein phosphopeptides）和细胞生长调节肽（Cytomodulatory peptides）等[12]。国外研究较多的是乳制品，亚洲研究较多的是大豆蛋白，可从发酵豆制品和其他的发酵食品中分离活性多肽。下表中列举了几个以大豆蛋白和牛奶蛋白为原料发酵生产活性肽的实例（表2）。

表2 发酵法生产活性肽Table.2 Fermentation of active peptide production

微生物发酵法所需原料必须富含蛋白质，产生的多肽片段有一定随机性。这种方法生产活性肽与其他方法的最大区别是可以通过食用发酵食品使人体得到一定的活性肽，而其他方法生产的活性肽，常常被添加到功能食品中或以胶囊形式被摄入。

2.3 人工合成法

人工合成法主要有化学合成法和基因工程法，这两种方法都需建立在已知需合成何种多肽的基础上。化学合成法一般采用固相合成法，即通过分析出多肽中氨基酸的组成及序列，将起始氨基酸（带有氨基保护基）的羧基端固定到不溶性树脂上，脱去树脂上氨基酸氨基端的保护基团，根据已知的氨基酸组成和序列，以酯键的形式按顺序将不同的氨基酸连接到固定的氨基酸上，使肽链不断延伸而形成目标肽链[17]。基因工程法则是在体外建立多肽合成系统，通过基因重组后在生物体内导入目的基因，利用廉价原料生产目的多肽的过程。这种方法前期基因导入与筛选过程花费大量的人力、物力，但研究成功后其应用前景广阔[18]。

3 生物活性肽分离纯化方法

用不同方法得到的活性多肽，由于其分子量大小、所带电荷及亲水性等性质的差异，则可利用不同的分离纯化方法将其分离纯化。

3.1 盐析法

多肽分子表面的亲水基团（-OH、-NH2、-COOH等）与水分子相互作用形成水化膜，向溶液中加入大量中性盐后，表面电荷被大量中和，从而使水化膜破坏，多肽分子相互聚集而沉淀析出，达到初步分离的目的。此法成本低，操作简单，对多肽有一定的保护作用，但会带入大量盐分。余芳等[19]按两步纯化（乙醇提取，硫酸铵沉淀）法提取富含脯氨酸的多肽（proline-rich polypeptides，PRP）。

3.2 超滤法（Ultrafiltration，UF）

在压力驱动作用下，使待分离的多肽分离通过适合孔径的滤膜，此法可分离不同大小的多肽，但不能将分子量极其相近的多肽分离。罗非鱼鱼皮蛋白酶解液[20]与大豆蛋白水解物[21]的分离均可用超滤法进行。

3.3 电泳法

在电场作用下，由于待分离样品中各种分子大小、形状及所带电荷不同，使带电分子具有不同的迁移速度，从而将样品进行分离或提纯的技术。

3.3.1 毛 细 管 区 带 电 泳 法（capillary zone electrophoresis，CZE） 此法是利用试样组分的荷质比不同对样品进行分离，样品的流出顺序为阳离子、中性粒子、阴离子。黄颖等[22]建立了两种简单的毛细管区带电泳（CZE）对3种肌肽类活性肽（肌肽、鹅肌肽、高肌肽）进行在线富集，即大体积进样反向压力排除基体富集和大体积进样电渗流排除基体富集。

3.3.2 SDS-PAGE电泳法 SDS-多肽复合物带大量负电荷，且远大于多肽自身的电荷，则多肽本身所带电荷对复合物的影响可以忽略不计。因此，SDS-多肽复合物在电场作用下，其淌度（电泳速度）主要取决于复合物分子质量的大小，从而按相对分子质量大小将多肽分离出来。刘丽娜等[23]利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出相对分子量分别为6.5ku和2ku左右的花生多肽。Liu等[24]将胶原蛋白经过一系列处理后，用SDS-PAGE（经离子活化和NBT染色）进行分离，置于考马斯亮蓝染液中，能估计分离多肽的大致质量范围。

3.4 高效液相色谱法（HPLC）

试样进入色谱柱后，溶质在两相间进行多次的连续交换分配，由于溶质在两相间分配系数、吸附能力、亲合力、分子大小不同引起的排阻作用而使多肽得以分离。王勇等[25]用制备型HPLC（流动相为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液）对泰和乌骨鸡进行分离后得到的13个组分都具有一定的抗氧化活性。

4 近期生物活性肽分离纯化研究方法

在基本分离方法的基础上发展起来的，或将其他领域的分离纯化方法应用于多肽的分离纯化方法。

4.1 Tricine-SDS-PAGE

Tricine-SDS-PAGE是建立在glycine-Tris和Tricine-Tris缓冲液系统基础上的分离蛋白质或多肽的SDS电泳技术。Tricine-SDS-PAGE与其他电泳系统的区别是所使用凝胶中丙烯酰胺含量较低，其分离蛋白质分子的质量范围为1～100ku，常用于分离分子质量小于30ku的蛋白质[26]。SDS-PAGE分离出相对分子质量为14～28ku小红豆蛋白，胰蛋白酶水解小红豆蛋白后，用Tricine-SDS-PAGE分离水解物，得到大多数片段的相对分子质量约为4ku[27]。

4.2 反相高效液相色谱（RP-HPLC）

RP-HPLC的固定相由疏水性功能团构成，在高效分离模式中，流动相的极性一般比固定相强。水解物经RP-HPLC分离后得到的是疏水性不同的多肽分子。流动相较简单，一般由甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水-盐或甲醇-水-盐等体系构成，流动相中有机溶剂浓度、pH和盐浓度的变化影响分离效果。

Castro-Rubio A等[28]利用RP-HLPC分离豆类和谷物中的蛋白质，可将其借鉴用于分离多肽。牛瑞、于建生[29]将鳕鱼蛋白水解物依次通过超滤、凝胶过滤层析、阴离子交换层析和RP-HLPC进行分离纯化，得到高纯度的鳕鱼多肽。

4.3 离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEC）

其分离机理主要是电场的相互作用，其次是非离子性的吸附作用。各种成分与固定相有不同的作用力导致在色谱柱中保留的时间不同而使样品分离。阴离子分离主要是采用季铵基作功能基的阴离子交换剂（anion-exchanger），阳离子的分离主要采用磺酸基和羧酸基作功能基的阳离子交换剂（cationexchanger）[30]。阳离子交换色谱分离到净阳离子多肽片段，而阴离子多肽分离到净阴离子多肽片段。离子交换色谱因固定相种类不同而具有不同的类型，如DEAE-Sepharose Fast Flow弱阴离子交换色谱、SPSephadex C-25阳离子交换色谱。使用时根据待分离多肽所带电荷不同而选择不同的离子交换色谱。

李蓉等[31]建立高效阳离子交换色谱法分离纯化蛋清中的溶菌酶，用氯化钠将蛋清样品匀浆初步纯化（盐析法）后用合成的弱阳离子交换柱XIDACEWCX进一步分离。程林友[32]在玻璃海鞘多肽的分离纯化中，通过70%丙酮沉淀、超滤截留、DEAESepharose Fast Flow弱阴离子交换色谱、Superdex-75凝胶过滤层析、HPLC、Tricine-SDS-PAGE等手段逐步分离得到玻璃海鞘多肽（Met-Val-Val-Pro-Pro-Asp-Gly-Gln-Ser-Glu-Cys-Pro-Asp-Gly-Asn）。

4.4 凝胶色谱法（gel chromatcgraphy，GC）

凝胶色谱又称分子筛过滤、体积排阻色谱、大小排阻/尺寸排阻色谱、凝胶排阻/过滤层析。利用分子筛作用对大小、形状不同的分子进行分离。当样品组分随溶液进入凝胶柱后，不同大小的组分进入到相应的凝胶孔径内，大于所有孔径的组分分子不能进入凝胶颗粒内部，只能沿着凝胶颗粒的缝隙随溶液流动[33]。质量越小的分子在凝胶颗粒之间流动的时间越长，质量较大的分子则会较早流出，从而根据分子质量的不同将混合物进行分离。

周国仪等[34]以鸡卵清蛋白为原料，利用酶工程法制得鸡卵清蛋白多肽，采用SephadexG-25和Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析、高效液相体积排阻色谱（HPSEC）、RP-HPLC等方法对鸡卵清蛋白多肽进行分离纯化。

4.5 亲和层析法（Affinity chromatography，AC）

亲和层析（affinity chromatography，AC）具有高选择性、高分离性及较大的载量[35]，将待纯化的某种多肽的特异配体通过一定的化学反应共价连接到载体表面的功能基上构成配基，多肽能自由通过载体。当含有目的多肽的混合样品通过该配基时，目的多肽与特异性配体结合而吸附在配基表面，其他物质则被洗出[35]。选择合适的洗脱液改变多肽与配基的结合条件而将多肽分离，用此方法分离多肽时需要选择能吸附待分离多肽的特异性配基。

刘柳等[36]以纳豆激酶的作用底物纤维蛋白为配基制备亲和层析胶，分离纯化纳豆激酶，且用琼脂糖包埋纤维蛋白制备的层析胶能够用于纳豆激酶的快速分离纯化。

4.6 离子交换离心分配色谱法

离子交换离心分配色谱是将离子交换色谱和离心分配色谱相结合的分离方法。通过加入液态的脂溶性弱阴（阳）离子交换树脂，使水相中待分离组分的阴（阳）离子和树脂络合的阴（阳）离子进行可逆交换进入有机相，其洗脱方式需根据流动相和固定相的相对密度决定：若下相为流动相，则用下降式洗脱模式；若上相为流动相，则用上升式洗脱模式；若分离可离子化成分，则采用pH区带精制模式洗脱[37]。

Boudesocque L等[38-39]用离子交换离心分配色谱法对多肽进行分离，其色谱体系及洗脱模式构成为：脂溶性的二（2-乙基己基）磷酸（DEHPA，di（2-ethylhexyl）phosphoric acid）作阳离子交换树脂，置换剂为CaCl2和HCl，采用下降式洗脱模式，其洗脱溶液体系是体积比为2∶1∶2∶5的甲基叔丁基醚/乙腈/正丁醇/水（methyl-tert-butylether/acetonitrile/n-butanol/ water）体系，用这个体系对苜蓿白色蛋白水解物中的降高血压肽（L-valyl-L-tryptophan（VW））进行分离，也用同样体系的离子交换离心分配色谱对GG（Gly-Gly）、GY（Gly-Tyr）、AV（Ala-Tyr）、LV（Leu-Var）及LY（Leu-Tyr）进行分离。

4.7 探针分离多肽

将要分离的纯多肽作为抗原，在生物体合成抗体（多肽），用固相酶联免疫吸附技术将合成的抗体分离。由于分离的抗体分子量较小，将其与其他的蛋白质（如BSA）结合，以达到制备探针的最佳分子量，蛋白质-抗体与特定的金属颗粒结合制备特定的分离探针，用这种探针来分离水解混合物中的特定活性多肽，结合到探针上的多肽用特异洗脱液洗脱下来。该法比其他的方法的分离时间短，且能节约分离时间，对功能性食品与医疗食品的发展有重要的意义。Fields C等[40]以纯化的BBI作为抗原，在生物体中合成出抗BBI的抗体（多肽），用固相酶联免疫法分离抗体，将分离抗体与BSA结合，然后与特定的氧化铁磁性粒子结合，制备成新颖的多肽分离探针。这种探针能快速分离大豆蛋白水解物中的BBI，分离效果高于其他传统的分离方法。

4.8 温度响应型聚合物刷分离多肽

通过ATRP（原子转移自由基聚合）反应在有气孔的基体表面接入温度响应型聚合物刷，将装载了聚合物刷的基体填入不锈钢柱中，将填充好的柱子连接到温度响应的HPLC中进行多肽的分离[41]。Mizutani A等[42]通过ATRP反应在多孔聚苯乙烯小珠上接入温度响应型聚合物刷（聚（N-异丙基丙烯酰胺）刷，即PIPAAm刷），将这种聚苯乙烯小珠当作填料填充柱子（4.6mm i.d.×150mm），填充好的柱子接入HPLC中，分离多肽的洗脱过程为热响应洗脱，能将血管紧张素亚型分离。Mizutani A等[43]还通过ATRP反应将聚N-异丙基丙烯酰胺-共-N-叔丁基丙烯酰胺刷接入聚羟基甲基丙烯酸酯（水解的聚甲基丙烯酸缩水甘油基酯-共-乙二醇二甲基丙烯酸酯）多孔小珠上，这种小珠可作为温度响应型色谱的固定相，可以将峰相近的多肽分离开，且分别率很高。

表3 部分活性肽生产关键方法和作用Table.3 Critical production method and function of parts of the active peptide

综合制备与分离纯化全过程，部分活性多肽生产过程中的关键方法和技术见表3。

在实验室分离纯化活性肽的过程中，一般是先用强酸型离子交换树脂和强碱型离子交换树脂进行脱盐处理，通过超滤的方法将带分离的活性肽分成不同分子量范围的肽段，再经过Tricine-SDS-PAGE、RP-HPLC、质谱等进一步纯化。根据分离活性肽的特性，选择合适的方法对其进行分离纯化。

5 展望

食源性活性肽的制备多采用酶解法和生物发酵法。蛋白质预处理技术、可控酶解技术、定向分离纯化技术是活性肽生产过程中的关键技术，在以后的研究中，需要注意发展这些关键技术的简易方法。在活性肽的分离纯化过程中要充分利用各种分离方法的优势，将其结合起来从蛋白水解液中定向分离出活性肽。同时要充分利用其他领域的分离方法，探索生物活性多肽分离纯化的有效方法。

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Research progress in the preparation，separation and purification of bioactive peptide derived from food

GE Ping-zhen，ZHOU Cai-qiong*
（Engineering&Technology Research Centre of Characteristic Food，Food Science College，Southwest University，Chongqing 400716，China）

In recent years，the bioactive peptide derived from food was more increasingly applied to functional foods，leading to the research on active peptide become a hot study topic on the food field.Preparation methods of bioactive peptide derived from food，containing enzymatic preparation，microbial fermentation and synthetic preparation，were introduced briefly，according to molecular weigher and electric charge of food-borne bioactive peptide.It was focused on the separation and purification of bioactive peptide derived from food.

active peptide derived from food；preparation；separation and purification

TS201.2

A

1002-0306（2014）04-0363-06

2013－07－18 *通讯联系人

葛平珍（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品安全与质量控制。