母乳微生物的研究进展

贾宏信，苏米亚，陈文亮，郭艳红，齐晓彦

（光明乳业股份有限公司研究院，乳业生物技术国家重点实验室，上海200436）

母乳微生物的研究进展

贾宏信，苏米亚，陈文亮，郭艳红，齐晓彦

（光明乳业股份有限公司研究院，乳业生物技术国家重点实验室，上海200436）

传统培养技术和现代分子学技术已证明母乳内具有多种微生物，包含葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、乳杆菌属和双歧杆菌属等。最新研究也证明母乳内的微生物，有些具有特殊的功能如抗HIV、治疗乳腺炎及通过孕产妇肠道到达乳腺等。本文就母乳内微生物的来源、种类、鉴定方法、特殊功能及应用的研究进行了综述，并展望了母乳微生物的研究方向，以期能为母乳微生物的进一步研究和利用提供指导。

母乳，母乳微生物，益生菌，乳腺炎，HIV

母乳是婴儿最健康的食物，母乳不但能为婴儿生长提供足够的营养物质，还能为婴儿提供肠道生长因子和生物活性物质，提高婴儿的耐受能力[1]。经母乳喂养的婴儿其呼吸道和胃肠道抗感染的能力较强[2]，哮喘和过敏性疾病的发病率较低[3]，疾病持续时间较短[4]。这也许与初乳和母乳内所包含的抗体、细胞因子、免疫活性细胞、多胺、低聚糖、乳铁蛋白和溶菌酶等的作用相关[4-5]。另外母乳内的微生物可以传递给婴儿，对婴儿肠道内的微生物群系产生一定的影响，某些微生物还具有抑制病原微生物在婴儿肠道内生长定殖的作用，如双歧杆菌，乳杆菌等[6-9]。母乳内微生物的特点有：来源安全（具有几千年被食用历史）；种类繁多（包含葡萄球菌、链球菌、乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌、不动杆菌属等）；具有传递性（能够通过母乳传递给婴儿，并在婴儿肠道内定殖）；重要的益生菌菌库（含乳杆菌属和双歧杆菌属两大益生菌属）；不同个体的母乳微生物种类存在差异，且同一产妇其母乳微生物组成和数量具有动态性；另外部分菌株具有抑菌、从产妇肠道通过乳腺进入母乳并传递给婴儿、治疗乳腺炎和抗HIV等作用。本文着重介绍研究者所关注的初乳和母乳内微生物的种类，来源和母婴间微生物的传递方式及母乳源益生菌的应用等，以期为母乳内微生物的进一步研究提供参考。

1 母乳微生物的来源

母乳内是否具有微生物一直备受争议，传统理论认为母乳由于受到污染才具有的微生物，这些污染源包括孕产妇皮肤和婴儿口腔内的微生物（主要发生在婴儿吮吸母乳时），孕产妇的肠道和阴道内微生物（主要发生在孕产妇生婴儿的过程中）。但是这一理论很难解释为什么严格厌氧菌双歧杆菌能在母乳内分离得到（表1），以及初乳内能分离得到多种细菌的问题[10]。因此越来越多的研究者相信母乳内的微生物来源存在其他路径，Perez等[11]2007年证明细菌可通过内生的路径到达孕产妇的乳腺，而树突状细胞（DCs）和巨噬细胞在这一通路的实现上起着重要作用。DCs能打开上皮细胞的紧密连接，把树突伸向上皮细胞外直接抓取细菌，而无需破坏上皮细胞的完整性[12]。另外DCs还能维持少量的共生细菌在肠系膜淋巴结存活几天[13]以及受抗原刺激的细胞能从肠粘膜移动到粘膜表面定殖，例如到呼吸道、泌尿生殖道、唾液腺、泪腺、特别是乳腺进行定殖，这些都为细菌伴随淋巴系统的循环到达人体的其他部位提供了条件。最新研究也证明母乳内微生物的来源存在一个内生的路径，Jiménez等[14]发现口服乳杆菌（唾液乳杆菌CECT5713和格氏乳杆菌CECT5714）胶囊制剂的乳腺炎患者，30d后乳杆菌能在60%的产妇母乳内分离得到；另外Arroyo等[15]也发现，口服发酵乳杆菌CECT5716的124位乳腺炎患者有67位的母乳内有发酵乳杆菌CECT5716检出，口服唾液乳杆菌CECT5713的127位乳腺炎患者有68位的母乳内有唾液乳杆菌CECT5713检出；Makino等[9]2011年研究8对母婴之间的双歧杆菌是否存在关联时发现，两株Bifidobacterium longum subsp.Longum分别专属于两对母婴，这两株菌分别都能从产妇的粪便和乳液，婴儿的粪便内分离得到。

2 母乳微生物的鉴定和种类

2.1 母乳微生物的鉴定

母乳微生物的传统分离法为培养基筛选法，该法首先把母乳内的微生物通过一定的选择性培养基筛选出来，再对菌株进行鉴定。这一方法的优点在于可以得到分离的菌株，可以实现计数，但是该法操作复杂繁琐，耗时。用于母乳内微生物分离的培养基有：培养非难养细菌、酵母和霉菌的脑心浸液（BHI），培养肠道菌的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA），培养难养菌的哥伦比亚萘啶酸琼脂（CNA），培养乳酸菌的卡那霉素七叶苷叠氮琼脂（KAA），培养厌氧菌的Wilkinse-Chalgren（WCh），培养乳酸菌和双歧杆菌的MRS，培养葡萄状球菌的Baird-Parker氏培养基（BP）以及培养总细菌的营养琼脂[10，16-18]。通过这些培养基的培养与筛选已分离出大量的母乳细菌（表1）。

母乳微生物的现代分析法为非培养依赖法，即分子学分析法，该法操作简单，直接进行母乳微生物DNA的多样性分析就可以得出微生物的种类与构成，但是该法无法分离得到菌株。目前应用于母乳内微生物组成分析的分子学方法有PCR-DGGE/TGGE，实时定量PCR（qRTi-PCR）和454焦磷酸测序等。PCR-DGGE/TGGE分析后可以根据数据库的比对分析出母乳微生物的种甚至亚种，如Martín等[19]用PCR-DGGE分析母乳细菌多样性时4个样品共分析出20多种细菌，包含人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、唾液链球菌、轻型链球菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌以及不动杆菌属和韦永氏球菌属等。而qRTi-PCR却仅能分析出复杂样品内某一类群微生物及数量，如Martín等用qRTi-PCR评价母乳内总细菌和双歧杆菌的数量[17]，比较母乳和婴儿粪便细菌组成的差异性[16]；Collado等[20]用qRTi-PCR分析母乳内细菌群落的多样性。qRTi-PCR分析常用的引物[16-17，20]，见表2。454焦磷酸测序因其高通量、快速、准确和灵敏度高等特点已应用于多种微生物区系的分析，Hunt等[21]2011年用454焦磷酸测序首次分析出母乳内存在沙雷氏菌属（Serratia）、罗尔斯通菌属（Ralstonia）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）。这些事例说明两种母乳菌相构成的分析方法，都存在各自的优越性，分子学可以快速和简便，而培养基筛选可以分离得到相应的菌株以便对菌株作进一步的研究。

表1 母乳内检测出的主要细菌菌属和菌种类别Table.1 Main bacterial genera and species detected in human milk

续表

2.2 母乳微生物的种类

初乳和母乳内都有复杂的微生物区系存在[10，20]，研究者通过微生物的分离鉴定证明母乳含有的微生物主要为葡萄球菌属（Staphylococcus）、链球菌属（Streptococcus）、肠球菌属（Enterorococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和明串珠菌属（Leuconostoc）等，而通过现代分子学技术进一步确定了母乳内存在复杂的微生物区系（表1）[8-11，16-34]。如Albesharat等[28]分析的15份母乳样品内主要细菌为溶血葡萄球菌（Staph.Haemolyticus）、解没食子酸链球菌（Streptococcus gallolyticus）、前庭链球菌（Str.vestibularis）、耐久肠球菌（Enterococcus durans）、海氏肠球菌（E.hirae）、蒙氏肠球菌（E.mundtii）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、口乳杆菌（L.oris）、动物乳杆菌（L.animalis）等；Collado等[20]用qRTi-PCR分析50份母乳细菌群落多样性发现，50份母乳都能检出葡萄球菌、链球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌，96%的母乳内能检出梭状芽胞杆菌XIVa-XIVb，76%的母乳能检出肠球菌。母乳内微生物得到分离并鉴定的菌株出现频率较高的为：表皮葡萄球菌、里昂葡萄球菌、人葡萄球菌、金黄葡萄球菌、唾液链球菌、轻型链球菌、粪肠球菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌（表1）。Jiménez等[10]2008年通过菌株的分离鉴定分析出36个初乳样品内有30个样品能检出表皮葡萄球菌（Staph.epidermidis），8个样检出里昂葡萄球菌（Staph.lugdunensis），4个样检出人葡萄球菌（Staph.hominis），15个样检出粪肠球菌（E.faecalis），9个样检出轻型链球菌（Str.mitis）和4个样检出肠膜明串珠菌（leuconostoc mesenteroides）等。不同的研究者所分析出来的母乳菌相构成有所差别可能与母乳样品的采集时间和采集个体有关[21，27，35]。Solís等[27]跟踪分析了20个母乳样在不同时间内（泌乳1、10、30和60d）乳酸菌和双歧杆菌的数量变化，发现母乳菌相构成为：1d时链球菌65%，葡萄球菌29%，肠球菌和双歧杆菌各3%；10d时链球菌38%，葡萄球菌50%，肠球菌8%，乳酸杆菌4%；30d时链球菌36%，葡萄球菌43%，双歧杆菌11%，乳酸杆菌7%，其他厌氧菌3%；60d时链球菌50%，葡萄球菌31%，双歧杆菌4%，乳酸杆菌11%，其他厌氧菌4%。另外魏斯氏菌属（Weissella）、沙雷氏菌属和罗尔斯通菌属、韦荣球菌属（Veillonella）、假单胞菌属（Pseudomonas）和鞘氨醇单胞菌属仅通过分子学技术得到了鉴定（表1），这可能说明这些菌株很难通过现有的选择性培养基培养分离得到，也进一步说明分子学技术在分析母乳菌相构成时可能更加客观。

表2qRTi-PCR引物Table.2 qRTi-PCR primers

3 母乳微生物的功能特性

母乳微生物具有抑制病原微生物生长[24，36]、调节免疫[37-39]、调节肠道健康[40-41]、增强流感疫苗的效果[42]，治疗乳腺炎[14-15]、减少婴儿胃肠道和上呼吸道感染[43]，产生抑菌物质[24，30，44]以及抗HIV[45-46]等作用。

3.1 母乳微生物的抑菌作用

Heikkilä等[24]研究母乳内微生物对一株金黄色葡萄球菌（能引起乳腺炎感染）的抑制时发现，分离得到的所有肠球菌、鼠李糖乳杆菌和弯曲乳杆菌都具有抑制葡萄球菌生长的作用，另外41%唾液链球菌及23%的表皮葡萄球菌也具有抑制金黄色葡萄球菌生长的作用。Olivares等[36]发现四株源自母乳的乳杆菌（唾液乳杆菌CECT5713，格氏乳杆菌CECT5714/CECT5715和发酵乳杆菌CECT5716）都能抑制猪霍乱沙门菌和金黄色葡萄球菌，以及部分菌株能抑制埃希氏大肠杆菌，李氏特菌和梭状芽孢杆菌的作用。Jara等[40]研究来自母乳的乳杆菌对12种胃肠道病原体（4株大肠杆菌，4株志贺氏菌，3株肠炎沙门氏菌和一株假单胞菌）的抑制作用发现，有4株乳杆菌对部分病原菌有抑制作用，2株乳杆菌能抑制这12种致病菌。这说明母乳内的乳杆菌具有较宽的抑菌谱。母乳内的某些菌株能产生抑菌物质，如Shea研究表明30%的母乳含有能产生乳酸链球菌肽的乳酸乳球菌[30]，而一株来自母乳的粪肠球菌C901被证明能产生肠道菌素C[44]。母乳微生物的葡萄球菌、链球菌、片球菌、乳酸乳球菌特别是乳杆菌还具有抗HIV的作用，如弯曲乳杆菌VM25致死菌体对R5 HIV-1感染的抑制率高达55.5%，格氏乳杆菌VM22的致死菌体对X4 HIV-1感染的抑制率高达81.5%，唾液链球菌VM18的致死菌体对X4 HIV-1和R5/X4 HIV-1感染的抑制率分别为81%和64%[45-46]（表3）。

表3 母乳乳酸菌对R5-、X4-和R5/X4-HIV-1的抑制作用Table.3 Inhibition of R5-，X4-and R5/X4-Tropic HIV-1 by LAB from Human Breast milk

3.2 母乳微生物的益生作用

菌株的肠道定殖能力以及食用安全是菌株成为益生菌的重要条件。2007年Villoslada等[47]用50只健康的BALB/c小鼠对唾液乳杆菌CECT5713的口服毒性进行了评估，结果表明即使小鼠食用CECT5713的剂量高于人体正常食用的10000倍也是安全的，作者初步得出食用CECT5713是安全的。2010年Maldonado等[48]研究婴儿食用益生菌食品（含CECT5713）对婴儿健康的影响时发现，食用CECT5713的婴儿和对照组婴儿在临床和体格检查上无显著性差异，而且还证明了食用CECT5713的婴儿其腹泻发生率和呼吸道感染率明显低于对照组。Gil-Campos等[49]的研究表明食用益生菌食品（含CECT5716）的婴儿和对照组相比婴儿（4-6mon）的体重和身高无显著差异，但是对照组婴儿的胃肠道感染发生率却是实验组的3倍。以上说明，CECT5713和CECT5716不但可以作为益生菌被人食用，同时也说明这两株菌能够调节人体肠道健康。CECT5713和CECT5716还具有提高人体免疫力的益生作用。Pérez-Cano等[38]2010年发现唾液乳杆菌CECT5713和发酵乳杆菌CECT5716具有加强人体先天性免疫和获得性免疫的能力，两株乳杆菌都能激活先天免疫的NK细胞，使CD8+NK亚群大量表达CD69；另外两株乳杆菌大约能激活9%的与获得性免疫有关的CD8+T细胞。这两株乳杆菌在体外还能诱导外周单个核细胞产生细胞因子和趋化因子，包含TNFα、IL-1β、IL-8、MIP-1α、MIP-1β和GM-CSF。

目前母乳来源的益生菌有唾液乳杆菌CECT5713、格氏乳杆菌CECT5714和发酵乳杆菌CECT5716[7]。这些菌株的益生特性表现为：唾液乳杆菌CECT5713具有肠道定殖和产抑菌物质[32]、抑菌[36]、免疫调节[37-38]、抗炎[50]、食用安全[47-48]、抗HIV（表3）[46]、改善成人肠道微生物[41]、治疗感染性乳腺炎[14-15]等作用。格氏乳杆菌CECT5714具有肠道定殖和产抑菌物质[31]、抑菌[36]、改善肠道功能[51]、提高人体免疫[39]、治疗感染性乳腺炎[14]等作用。发酵乳杆菌CECT5716具有肠道定殖和产抑菌物质[31]、抑菌[36]、减轻肠道炎症[52]、免疫调节[38]、治疗感染性乳腺炎[15]、增强流感疫苗效果[42]、婴儿食用安全[49]、减少婴儿胃肠道和上呼吸道感染的发病率[43]等作用。

3.3 母乳微生物的生物治疗作用

分离自母乳的益生菌（CECT5713、CECT5714和CECT5716）具有作为生物治疗剂的潜力。乳腺炎是产妇哺乳期常见的疾病，一般认为金黄色葡萄球菌是引起急性乳腺炎的病原体，而表皮葡萄球菌与慢性或亚急性乳腺炎有关。上面提到来自母乳的微生物大多有抑制金黄色葡萄球菌的能力，而Jiménez等[14]和Arroyo等[15]的实验证明哺乳期产妇口服CECT5713、CECT5714和CECT5716能治疗乳腺炎。Jiménez把20位患有乳腺炎的患者随机均分为两组，实验组每天口服含有益生菌CECT5713和CECT5714的甲基纤维素胶囊，对照组仅服用无益生菌的胶囊。实验开始前两组患者母乳内葡萄球菌的数量无显著差异，母乳都无乳杆菌的检出。14d后实验组的患者已无乳腺炎的临床症状，30d后实验组患者母乳内葡萄球菌的数量为2.96lg CFU/mL，远低于对照组（4.97lg CFU/mL），而且有6位患者的母乳内分离得到了CECT5713和CECT5714。Arroyo却以患者分别服用CECT5713和CECT5716治疗乳腺炎的实验组（两组：A，n=124；B，n=127）和一组进行抗生素治疗的对照组（C=101）相比证明这两株益生菌都能治疗乳腺炎。0d时3组患者的母乳内葡萄球菌的数量无显著差异，并且无乳杆菌的检出。21d时实验组患者母乳内葡萄球菌的数量为2.61和2.33lg CFU/mL，对照组为3.28lg CFU/mL，并且能在服用益生菌的对应母乳内分离得到CECT5713或CECT5716。该实验也证明了益生菌治疗康复的乳腺炎患者，乳腺炎的复发率远低于抗生素治疗的患者。Jiménez和Arroyo的实验提醒我们，母乳分离得到的菌株可开发为具有特殊功能作用的生物治疗剂，同时鉴于母乳内有些微生物还具有抑制HIV的能力，因此母乳可以作为一个筛选益生菌的重要菌库，有待于进一步的开发利用。

4 展望

健康产妇母乳内微生物的研究现在还处于起步阶段，仅仅有十来年的历史。现已研究发现健康产妇的母乳内含有多种微生物，包含葡萄球菌属、链球菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属和肠球菌属等。虽说随着科学技术的进步和现代分子学的发展，母乳内的微生物被发现的越来越多，但是母乳内微生物的具体种类还不完全清楚，特别是有些菌株还不能由培养基分离得到，仅能由分子学方法鉴定得出，因此对母乳内微生物种类还需要更进一步的分析研究。母乳内分离得到的微生物被证明具有特殊的功能特性，如抑菌，可由肠道到达乳腺，抗HIV，治疗乳腺炎等，说明母乳可以作为筛选具有特殊功能益生菌的菌库。因此筛选具有特殊益生特性的菌株应该是研究工作者重点关注的一个研究方向，同时有关菌株由肠道迁移至乳腺的机制也是不容忽视的研究课题。

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Research progress in the microorganism in breast milk

JIA Hong-xin，SU Mi-Ya，CHEN Wen-Liang，GUO Yan-Hong，QI Xiao-Yan
（State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Technology Center of Bright Dairy and Food Co.，Ltd.，Shanghai 200436，China）

Traditional culture techniques and modern molecular techniques have showed many microorganisms are in the breast milk including Staphylococcus，Streptococcus，Enterococcus，Lactobacillus and Bifidobacterium，etc.Recent studies have demonstrated that some microorganisms in breast milk have special function such as anti-HIV，curing mastitis，getting into breast through the intestinal and so on.It was reviewed that the source，type，identification methods，special function and application of the breast milk microorganisms.This paper also provided an outlook of the research direction for microorganisms in breast milk and provided some guides for the further research and utilization of microorganisms in breast milk.

breast milk；breast milk microorganisms；probiotics；mastitis；HIV

TS201.3

A

1002-0306（2014）04-0350-08

2013－08－02

贾宏信（1985-），男，硕士研究生，研究方向：乳品科学。

科技部农业科技成果转化资金（2012GB2CO00141）；上海市科委国际合作项目（11290704400）。