双花露纯天然植物饮料成分分析

唐 清，王森弘，李燕君，杨 盛，徐晓玉

（西南大学药学院/中医药学院，西南大学中药研究所，重庆市药效评价工程技术研究中心，重庆市银花工程技术研究中心，重庆400716）

双花露纯天然植物饮料成分分析

唐 清，王森弘，李燕君，杨 盛，徐晓玉*

（西南大学药学院/中医药学院，西南大学中药研究所，重庆市药效评价工程技术研究中心，重庆市银花工程技术研究中心，重庆400716）

对双花露纯天然植物饮料中所含药用有效成分及营养成分的含量进行了检测。RP-HPLC法、紫外分光光度法、氨基酸自动分析仪法和原子吸收光谱法分别用于检测绿原酸、总黄酮、氨基酸和矿质元素的含量。结果表明：双花露纯天然植物饮料中所含绿原酸含量为301.61μg/mL，总黄酮含量为2.93mg/mL，氨基酸总含量为2.607mg/100mL，矿质元素Fe、Ca、K、Na、Mg、Zn的含量分别为2.65、4.66、119.55、101.47、11.36、0.52μg/mL。双花露纯天然植物饮料含有丰富的药用有效成分及营养成分，值得进一步推广。

双花露纯天然植物饮料，绿原酸，总黄酮，氨基酸，矿质元素

双花露纯天然植物饮料为西南大学药学院研发的一款纯天然植物饮品，其主要原料为秀山银花与杭白菊。

秀山银花产于重庆秀山县，主要品种为灰毡毛忍冬。2005年版《中国药典》（一部）首次将灰毡毛忍冬归类为山银花，并对其作了详细的描述[1]，其气清香，味微苦甘，性味归经、功能主治等均与忍冬一致。经冯彬彬等[2]测定，秀山银花所含有效成分绿原酸的含量高达9.03%，比山东平邑（4.08%）和河南封丘（3.79%）等地所产金银花的绿原酸含量均高出很多。杭白菊为菊科多年生草本植物，盛产于浙江桐乡市、海宁市，其花瓣洁白如玉，花蕊黄如纯金，古时曾作贡品，素有“千叶玉玲珑”的美名。杭白菊不仅具有很高的营养价值，而且具有很高的药用功效，含有挥发油、总黄酮、绿原酸等有效成分，常饮能散风清热、平肝明目、消疲怡神[3]。现代药理研究表明，杭白菊具有抗氧化[4]、保护心血管[5]、降血脂[6]、抗菌消炎[7]及抗肿瘤[8]等作用。

双花露纯天然植物饮料含有多种药用有效成分及营养成分。本文主要测定双花露纯天然植物饮料中所含绿原酸、总黄酮、氨基酸、矿质元素等成分的含量，为双花露纯天然植物饮料的进一步推广提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

双花露 重庆秀沧生态农业开发有限公司，批号：20130424A，食品生产许可证号：QS501506010093，规格：248mL；绿原酸对照品 中国药品生物制品检定所，纯度96.6%；芦丁对照品 中国药品生物制品检定所，纯度92.5%；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、乙醇、氢氧化钾、无水乙醇、硝酸、高氯酸、硫酸、硫代硫酸钠、石油醚、乙醚等 成都科龙化工厂，分析纯。

1200型高效液相色谱仪 带紫外检测器，美国Agilent technologies；L-8800型全自动氨基酸分析、U-3010型仪紫外可见分光光度计 日本HITACHI公司；TAS-990型原子吸收分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；超声波清洗器、万分之一电子天平、pH计、EL2046型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 绿原酸含量检测

1.2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品0.0710g，置于100mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，摇匀，即得浓度为710μg/mL的标准品贮备液。

1.2.1.2 样品溶液的制备 准确量取5mL饮料样品于蒸发皿中，80℃恒温水浴锅上蒸干，用50%的甲醇溶解并定容至25mL容量瓶中，过滤，得到样品溶液。

1.2.1.3 色谱条件 platisil ODS色谱柱（250mm× 4.6mm，5μm）；以0.2%H3PO4∶乙腈=87∶13为流动相；检测波长326nm；进样量20μL；流速为1.0mL/min；柱温25℃。

1.2.1.4 标准曲线的绘制 精密吸取浓度为710μg/mL的标准品母液配制成以下5个浓度：71.0、42.6、28.4、14.2、7.1μg/mL，用0.22μm微孔滤膜过滤后，置于样品瓶中，按照上述色谱条件进行HPLC测定，作峰面积对浓度的标准曲线，求出线性回归方程。

1.2.1.5 样品分析 在相同的色谱条件下，将样品溶液注入液相色谱仪中进行HPLC测定，采用外标法进行定量[9]。

1.2.2 总黄酮含量检测

1.2.2.1 对照品溶液的制备 称取0.2000g干燥至恒重的无水芦丁，置于100mL容量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀，得2.00mg/mL标准贮备溶液。吸取10.00mL芦丁标准贮备溶液于100mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，得到0.2mg/mL的芦丁对照品溶液[10]。

1.2.2.2 样品溶液的制备 准确量取5mL饮料样品，置于蒸发皿中，80℃恒温水浴锅上蒸干，用50%甲醇溶解并定容至25mL容量瓶中，过滤，得到样品溶液。

1.2.2.3 显色方法及检测波长的选择 精密吸取芦丁对照品溶液及样品溶液各2mL置于25mL容量瓶中，补水至约10mL，以空白试剂为对照，加1.0mL 50g/L亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6min，加1.0mL 100g/L硝酸铝溶液，摇匀，放置6min，加4.0mL 200g/L氢氧化钠溶液，再加水至刻度，摇匀，放置15min。用1cm比色皿，400～800nm波长范围内进行扫描，选取最大吸收波长为检测波长。

1.2.2.4 标准曲线的绘制 精密吸取芦丁对照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、9.00mL置于25.00mL容量瓶中。按“1.2.2.3”中方法，以相应试剂作空白，分别在最大吸收波长处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标（Y），以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标（X），绘制标准曲线。

1.2.2.5 样品分析 精密吸取2mL样品溶液，按“1.2.2.3”中方法，以相应试剂作空白，在最大吸收波长处测定吸光度，根据标准曲线回归方程计算样品的总黄酮含量（以芦丁计）。

1.2.3 氨基酸的检测

1.2.3.1 样品处理 准确量取饮料样品250mL置于圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪减压浓缩至50mL。取5mL浓缩液置于50mL烧杯中，加入0.2mL 4%磺基水杨酸溶液振荡摇匀，用0.22μm滤膜过滤，备用[11]。

1.2.3.2 分析条件 一个样品分析周期53min，仪器设有分离柱和反应柱，即a.分离柱（4.6mm×60mm）：柱温700℃、柱压10.678MPa、洗脱液以0.4mL/min流速流经此柱；b.反应柱：柱温1350℃、柱压0.982MPa、茚三酮及茚三酮缓冲液以0.35mL/min流速流经此柱。

1.2.4 矿质元素分析

1.2.4.1 样品处理 称取饮料样品5.0g，置于50mL锥形瓶中。加入消化液10mL（硝酸∶高氯酸=4∶1），混匀，150℃油浴加热消化至澄清透明。放冷，用5%硝酸溶液洗涤锥形瓶，洗液转入25mL容量瓶中，稀释至刻度[12]，备用。

1.2.4.2 分析条件 按原子吸收光谱法测定Fe、Na、Ca、K、Mg、Zn的含量。原子吸收光谱检测条件见表1。

表1 原子吸收光谱仪工作条件Table.1 Working conditions of AAS assay

2 结果与分析

2.1 绿原酸的含量测定结果

2.1.1 标准曲线 以对照品浓度为横坐标（x），色谱峰面积为纵坐标作图（y），得到线性回归方程为：y= 5.2065x-5.5733，r=0.9999。表明绿原酸浓度在7.1～71.0μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.1.2 精密度实验 取对照品溶液适量，重复进样6次，测定绿原酸的含量。计算得相对标准偏差（RSD）＝0.039%，表明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性实验 取同一供试品溶液适量，分别于0、2、4、6、8、12、24h进样，测定绿原酸的含量。结果见表2，RSD＝1.31%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.1.4 重复性实验 精密量取同一批样品，共6份，每份约5mL，分别按“1.2.1.2”项下方法制备样品溶液，测定绿原酸的含量。结果见表3，RSD＝1.01%，表明方法重复性良好。

2.1.5 加样回收率实验 量取9份已知含量的样品5mL，分别加入对照品3个浓度梯度共9份，按“1.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表4。

2.1.6 样品含量的测定 取3批样品（批号：20130423、20130424、20130510）各5mL，分别按“1.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，取20μL进样，按上述色谱条件测定峰面积，计算含量。结果显示，3批样品中绿原酸的含量分别为290.15、305.23、309.44μg/mL，平均含量为301.61μg/mL。

表2 稳定性实验结果（，n=3）Table.2 Stability test results（，n=3）

表2 稳定性实验结果（，n=3）Table.2 Stability test results（，n=3）

时间（h） 0 2 4 6 8 12 24 RSD（%）绿原酸含量（μg/mL） 305.27±0.72 304.79±0.29 304.50±0.77 304.21±0.58 303.35±1.44 302.29±0.60 301.81±0.48 1.31

表3 重复性实验结果（，n=3）Table.3 Reproducibility test results（，n=3）

表3 重复性实验结果（，n=3）Table.3 Reproducibility test results（，n=3）

编号 1 2 3 4 5 6 RSD（%）绿原酸含量（μg/mL） 305.74±0.93 304.05±0.38 306.23±0.77 306.90±0.67 304.88±1.34 305.17±1.06 1.01

表4 加样回收率实验结果（，n=3）Table.4 Recovery test results（，n=3）

表4 加样回收率实验结果（，n=3）Table.4 Recovery test results（，n=3）

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9RSD（%）回收率（%） 96.7±0.3 95.3±0.4 102.4±0.6 99.3±0.2 100.2±0.1 103.4±0.4 107.8±0.8 104.4±0.6 109.2±0.4 4.7

图1为绿原酸含量测定液相色谱图，在流动相为0.2%H3PO4∶乙腈=87∶13时，样品中的绿原酸达到很好的分离效果。

图1 绿原酸含量测定色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of chlorogenic acid

2.2 总黄酮的含量测定结果

2.2.1 最大检测波长的确定及标准曲线线性关系考察 紫外扫描结果显示（图2），在510nm处芦丁对照品有最大吸收，且该波长处样品也有较强吸收，故确定检测波长为510nm。经线性回归表明，芦丁浓度在8～72μg/mL范围内呈良好的线性关系。回归方程为：y=0.0121x+0.0021，r=0.9999。

图2 总黄酮UV扫描图谱Fig.2 UV graphs of total flavonoids

2.2.2 精密度实验 精密量取芦丁标准对照品溶液6份，置于10mL试管中，参照“1.2.2.3”中方法，在510nm处测定吸光度，根据标准曲线的回归方程计算各份总黄酮含量。结果RSD=0.22%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性实验 精密量取样品溶液适量，参照“1.2.2.3”中方法操作，显色后不同时间测定其吸光度变化，即放置5、10、15、30、45、60、90、120、150min后，分别测定其吸光度，根据标准曲线的回归方程计算总黄酮含量。结果见表5，RSD=1.22%，表明方法稳定性较好。

2.2.4 重复性实验 精密量取同一批号饮料样品6份，每份约5mL，照样品溶液制备方法制备。精密吸取各样品溶液适量，参照“1.2.2.3”方法操作，在510nm处测定吸光度，根据标准曲线的回归方程计算各份总黄酮含量。结果见表6，RSD=1.22%，表明方法重复性良好。

表5 稳定性实验结果（，n=3）Table.5 Stability test results（，n=3）

表5 稳定性实验结果（，n=3）Table.5 Stability test results（，n=3）

时间（min） 0 5 10 15 30 45 60 90 120 150 RSD（%）总黄酮含量（mg/mL） 2.91±0.01 2.91±0.01 2.90±0.01 2.89±0.00 2.88±0.01 2.87±0.01 2.86±0.01 2.85±0.00 2.82±0.01 2.80±0.01 1.22

表6 重复性实验结果（，n=3）Table.6 Reproducibility test results（，n=3）

表6 重复性实验结果（，n=3）Table.6 Reproducibility test results（，n=3）

编号 1 2 3 4 5 6 RSD（%）总黄酮含量（mg/mL） 2.77±0.01 2.76±0.00 2.80±0.01 2.85±0.01 2.79±0.01 2.84±0.00 1.01

表7 加样回收率实验结果（，n=3）Table.7 Recovery test results（，n=3）

表7 加样回收率实验结果（，n=3）Table.7 Recovery test results（，n=3）

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9RSD（%）回收率（%） 102.4±0.4 103.2±0.2 102.4±0.4 101.7±0.7 101.7±0.2 105.4±0.3 103.2±0.0 103±0.2 103.2±0.2 1.1

2.2.5 加样回收率实验 精密量取已知总黄酮含量饮料样品9份，每份约5mL，置于25mL的量瓶中，再按80%、80%、80%、100%、100%、100%、120%、120%、120%加入芦丁对照品，各份均照样品溶液制备方法制备。精密吸取各样品溶液适量，参照“1.2.2.3”中方法操作，在510nm处测定吸光度。计算加样回收率，结果见表7。

2.2.6 样品含量的测定 取3批样品（批号：20130423、20130424、20130510）各5mL，按“1.2.2.2”中方法处理样品，按“1.2.2.3”中的方法检测各个样品的吸光度值，计算其总黄酮含量。结果显示：3批样品分别为2.81、3.01、2.96mg/mL，平均含量为2.93mg/mL。

2.3 氨基酸检测结果

利用氨基酸自动分析仪共检测了17种氨基酸，检测结果见表8。其中脯氨酸、谷氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸及苯丙氨酸含量较为丰富，均高于0.1mg/mL。图3为氨基酸的分离图谱，各氨基酸分离良好。

表8 氨基酸检测结果（n=3）Table.8 Detection result of amino acids（n=3）

2.4 矿质元素分析结果

利用原子吸收光谱法共检测了6种矿质元素的含量，检测结果如表9所示。其中K、Na、Ca、Mg四种元素为常量元素，含量较高，而Fe和Zn为微量元素，含量相对较低。

图3 双花露中各氨基酸的分离图谱Fig.3 Chromatogram of each amino acid in Shuang Hua Botanical Beverage

表9 矿质元素含量测定结果（n=3）Table.9 Content of mineral elements（n=3）

3 结论与讨论

绿原酸是秀山银花中的主要药效物质之一，具有多种生物药理活性[13]。如抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基等。黄酮类化合物是植物中分布最广泛的一类物质，它们常以游离态或与糖结合成苷的形式存在[14]。黄酮类化合物不仅具有较强的天然抗氧化性，而且具有强有力的自由基清除性。此外，黄酮类化合物还被证实有较强的生物活性，如预防心血管疾病、抗衰老、抗菌、抗病毒、防癌抗癌、调节免疫等[15]。检测结果显示双花露纯天然植物饮料中绿原酸含量为301.61μg/mL，总黄酮含量为2.93mg/mL，浓度均较高，是该饮料中主要的功能性物质。

氨基酸与矿质元素均为双花露纯天然植物饮料中重要的营养成分。氨基酸组成和含量是评价蛋白质量的重要指标[16]。双花露纯天然植物饮料中氨基酸总类齐全，共检测出17种常见氨基酸成分，其总含量为2.607mg/100mL。其中含有苏氨酸、赖氨酸、缬氨酸等体必需的氨基酸7种（因方法原因，本文未检测出另一种人体必需氨基酸色氨酸），非必需氨基酸10种，人体必需的氨基酸占到氨基酸总量的24.1%。其中，天冬氨酸、谷氨酸是呈鲜味的特征氨基酸，丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸是呈甘味的特征氨基酸[17]，这些氨基酸的存在为双花露纯天然植物饮料的良好口感提供了一定基础。另外，矿质元素与人体的健康有着密切的联系，许多元素都有着重要的生理功能[18]。如铁是人体必需的微量元素之一，它能与血红蛋白结合，参与氧的运输。钠是人体中一种重要无机元素，参与水的代谢，保证体内水的平衡，调节体内水分与渗透压，并对维持神经、肌肉的正常功能起作用。而钾是构成人体生理必需的化学元素，参与细胞内糖和蛋白质的代谢，与钙、氯等离子一起维持神经、肌肉的正常兴奋性，并且还能协调正常心肌的舒张和收缩运动[19]。双花露纯天然植物饮料中检测出了丰富的铁、钙、钠、钾等矿质元素，其中钠和钾元素的含量最高，分别为101.47μg/mL和119.55μg/mL。

本研究证明，双花露纯天然植物饮料中含有丰富的药用有效成分及营养成分，值得进一步开发推广。

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Component analysis of Shuang Hua botanical beverage

TANG Qing，WANG Sen-hong，LI Yan-jun，YANG Sheng，XU Xiao-yu*
（College of Pharmaceutical Sciences&College of Traditional Chinese Medicine，Southwest University，Institute of Chinese Medicine，Southwest University，Chongqing Engineering Research Center for Pharmacological Evaluation；Chongqing Engineering Research Center for Flos Lonicerae，Chongqing 400716，China）

The medicinal component and nutrient content of Shuang Hua botanical beverage was detected.RPHPLC，Ultraviolet spectrophotometer，Automatic amino acid analyzer and Atomic absorption spectrophotometry were used to detect contents of chlorogenic acid，total flavonoids，amino acids and mineral elements，respectively.The result showed that the content of chlorogenic acid in Shuang Hua botanical beverage was 301.61μg/mL，total flavonoids was 2.93mg/mL，total amino acid content was 2.607mg/100mL.The mineral content of Fe，Ca，K，Na，Mg and Zn were 2.65，4.66，119.55，101.47，11.36 and 0.52μg/mL，respectively.Shuang Hua botanical beverage contained affluent medicinal components and nutrients.It was worthy of further development and utilization.

Shuang Hua botanical beverage；chlorogenic acid；total flavonoids；amino acid；mineral element

TS275.4

A

1002-0306（2014）04-0346-05

2013－07－31 *通讯联系人

唐清（1989-），女，硕士研究生，研究方向：药物分析。

国家科技支撑计划课题（2006BAC01A16）子课题；2013年重庆高校创新团队建设计划资助项目；秀山县人民政府资助项目（XS20120610）。