采后纳米氧化锌对苹果黑斑病和青霉病的控制

刘瑾瑾，李永才，*，刘昌宁

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃兰州730070）

采后纳米氧化锌对苹果黑斑病和青霉病的控制

刘瑾瑾1，李永才1，*，刘昌宁2

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃兰州730070）

通过离体（in vitro）和体内（in vivo）实验，研究了纳米氧化锌处理对苹果采后主要致腐病菌Alternaria alternata和Penicillium expansum生长的抑制及对病害的控制效果。结果表明：纳米氧化锌对两种病菌的菌丝生长均具有明显的抑制作用，且抑制效果随浓度的升高而增加，其中20%的纳米氧化锌对A.alternata和P.expansum的抑菌率分别达到86.85%和49.60%，对前者抑制效果显著优于后者。20%纳米氧化锌处理对A.alternata孢子萌发的抑制较对照下降了87.37%，而15%纳米氧化锌处理对P.expansum孢子萌发的抑制较对照下降了94.56%。同时纳米氧化锌也显著降低了损伤接种A.alternata和P.expansum苹果病斑直径的扩展，其中以5%纳米氧化锌处理效果最好，分别与对照相比降低了76.24%和65.32%，更高浓度处理并没有增强抑制效果。由此表明，纳米氧化锌可通过直接抑菌作用来减轻苹果黑斑病和青霉病的发生。

苹果，纳米氧化锌，互隔交链孢，扩展青霉

苹果（Malus domestica）是我国北方地方广泛种植的水果，虽然苹果具有良好的贮藏性，但在贮藏后期腐烂病的发生率仍然较高。苹果的腐烂病与多种真菌的侵染有关，链格孢（Alternaria alternata）引起的黑斑病以及扩展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是主要病害[1]。虽然化学杀菌剂可有效控制苹果腐烂，但容易造成杀菌剂残留和环境污染，并能诱导病原物产生抗药性，从而使其应用受到限制。因此，研究并利用化学杀菌剂的替代物来防治果蔬的病害已势在必行[2]。

氧化锌（ZnO）是一种无机金属型氧化物，能够补充人体必须的矿物元素锌，而且纳米ZnO与人体细胞有很好的组织相容性[3]，并具有极好的抗氧化和抗腐蚀能力，高的熔点，良好的机电耦合性、屏蔽紫外线能力及杀菌除臭性[4-5]，使其在光电器件、化工、涂料、医药等众多方面有着广泛的应用。目前，纳米氧化锌的抗菌作用研究主要集中于细菌方面，研究发现纳米氧化锌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有一定的抗菌性能，且对大肠杆菌的杀菌效果好于金黄色葡萄球菌，其杀菌机理是利用纳米氧化锌产生的活性氧种造成微生物损伤而实现抗菌，与其光催化机理相似[6-7]。卢亢[8]还发现负载纳米氧化锌的海藻酸纤维能够在24h内杀灭溶液中2×106cfu/mL的大肠杆菌和4×103cfu/mL的金黄色葡萄球菌，随锌含量增加，其抗菌能力提高。为了进一步确定纳米氧化锌对细菌的作用方式和机理，江霞等[9]研究表明，ZnO与大肠杆菌K88作用时，首先被吸附到大肠杆菌K88的表面，随着作用时间的延长，菌体的细胞壁被破坏，细菌的形态也随之发生改变，这会使菌体对渗透压的敏感性增强，最终破裂死亡。近年来研究还发现纳米ZnO能有效的抑制镰刀菌[10]、灰葡萄孢和扩展青霉[11]等真菌的生长。但有关纳米氧化锌对苹果A.alternata和P.expansum的体外抑菌实验及对采后病害的控制的研究尚未见报道。因此，本文拟采用离体（in vitro）和体内（in vivo）实验，研究不同浓度纳米氧化锌对苹果A.alternata和P.expansum的体外抑制效果和对损伤接种苹果病斑直径的影响，以期为苹果采后病害的防治提供安全有效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试红富士苹果 2013年4月购于兰州市安宁区桃海农贸市场，选择外观整齐，大小均匀，无病虫害的果实，单果包纸，纸箱包装后运抵本校实验室，室温（25±2）℃贮藏待用；纳米氧化锌（20%浓度） 购于江苏逸振科技有限公司。

SW-CJ-2FD型超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；VXH-3型微型漩涡混合器 上海跃进医疗器械厂；CX21FS1C型生物显微镜 奥林巴斯（广州）工业有限公司；DHP-9272B型恒温培养箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制作 参照文献[12]中的方法并进行修改。制作马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA，培养基成分：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。将马铃薯切碎，加水煮沸30min后过滤。同时将糖和琼脂分别溶解后与马铃薯过滤液混合，并定容至1000mL。分装在三角瓶中进行高压灭菌。灭菌后制备平板PDA。

1.2.2 病原菌的分离纯化 参照文献[12]中的方法。分别采集典型苹果黑斑病和青霉病的病果，用70%酒精表面消毒，无菌水冲洗后，切取病健交界处组织，在无菌操作条件下移置到马铃薯葡萄糖琼脂PDA平板上，于25℃保温培养，待长出分生孢子后，进行单孢分离、纯化后在PDA培养基上保存待用。

1.2.3 不同浓度纳米氧化锌处理对A.alternata和P.expansum菌落直径的影响 参照范青等[13]方法，先分别将1mL 5%、10%、15%和20%的纳米氧化锌溶液溶于灭菌后的150mL PDA培养基中，以不添加纳米氧化锌作为对照，混合均匀后再分别倒入90mm的培养皿内，待培养基冷却后，将用无菌打孔器打好的A.alternata和P.expansum菌饼（直径10mm）接种于培养基中央，25℃避光培养。当对照皿中菌体长至培养皿边缘时，测定病斑直径。并按下式计算抑菌率。每处理设平行3个，重复3次。

抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-原菌饼直径）×100

1.2.4 孢子悬浮液的制备 参照文献[14]中的方法并修改。取25℃下培养7d的带菌PDA平皿一个，加入含0.05%Tween80的无菌水约10mL，用玻璃棒刮下平板上的A.alternata和P.expansum孢子，然后转入50mL三角瓶中，在微型旋涡混合器上振荡15s，再用双层纱布过滤，滤液用血球计数板计数算出孢子悬浮液的浓度后，最后稀释至所需浓度（1×105孢子/mL）。

1.2.5 不同浓度纳米氧化锌处理对A.alternata和P.expansum孢子萌发的影响 参照孙小娟[15]方法。用打孔器取直径为10mm的2%琼脂培养基并将其置于灭菌的载玻片上，然后分别加入10μL 5%、10%、15%和20%纳米氧化锌溶液于培养基上，以添加相同量的无菌水作为对照，再在其上加入10μL孢子悬浮液。置于25℃下，连续数小时镜检萌发率，直到对照基本完全萌发。每次镜检100个孢子，重复3次。

1.2.6 不同浓度纳米氧化锌处理对损伤接种苹果病斑直径的影响 参照毕阳[16]方法并修改。选择外观整齐，无病虫害的苹果果实，2%NaClO进行浸泡消毒2～5min，再用清水冲洗掉，待晾干后用70%酒精表面消毒，再用灭菌铁钉（直径3mm）在果实上均匀刺3mm深的伤口4个，15min待孔内汁液晾干后，分别向孔内注射1×105个/mL的A.alternata孢子悬浮液20μL，3h后，再分别用浓度为5%、10%、15%、20%的纳米氧化锌溶液浸泡3min。用同样的方法接种P.expansum，并用同样浓度的纳米氧化锌进行处理，以接种后无菌水处理为对照。果实处理后，用PE薄膜包裹，在（20±2）℃下贮藏。每处理用果3个，每处理重复3次。

1.3 数据处理

接种青霉的果实在8d后测定发病率及病斑直径，接种链格孢的果实在10d后测定发病率及病斑直径。发病率以发病病斑数占接种病斑数的百分率计，病斑直径采用十字交叉法测量。数据处理采用Excel 2007和SPASS17.0统计软件进行邓肯氏多重差异分析（p＜0.05）。柱形图中竖线代表标准误差，不同字母表示在p＜0.05水平上的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 纳米氧化锌处理对A.alternata和P.expansum菌落直径的影响

纳米氧化锌处理可显著抑制A.alternata和P.expansum菌落直径的扩展，且抑制效果随浓度的升高而增强（图1A，图1B）。其中5%的纳米氧化锌显著抑制了A.alternata菌落生长（p＜0.05），菌落直径仅为对照的47.32%，当浓度逐渐增至20%时，菌落直径仅为对照的23.49%（图1A）。P.expansum对纳米氧化锌处理表现出较好的耐受性，当浓度增至20%时才明显抑制P.expansum的菌落扩展，菌落直径仅为对照的66.43%（图1B），可见纳米氧化锌能有效的抑制该菌的生长。

图1 纳米ZnO处理对A.alternata（A）和P.expansum（B）菌落直径的影响Fig.1 Effects of nano-zinc oxide on mycelial growth of A.alternata（A）and P.expansum（B）

2.2 纳米氧化锌处理对A.alternata和P.expansum孢子萌发的影响

图2 纳米氧化锌处理对A.alternata（A）和P.expansum（B）孢子萌发的影响Fig.2 Effects of nano-zinc oxide on spore germination of A.alternata（A）and P.expansum（B）

纳米氧化锌可有效抑制A.alternata（图2A）和P. expansum（图2B）的孢子萌发。在5%～20%的处理浓度范围内，二者的孢子萌发率均显著低于对照。当浓度为5%时，A.alternata和P.expansum的孢子萌发率分别为对照的39.07%和18.13%，随着纳米氧化锌浓度的增加抑制效果也越好，当浓度为15%时，A.alternata和P.expansum的孢子萌发率与同期对照相比分别降至13.54%和29.99%；当浓度进一步增加至20%时，纳米氧化锌对A.alternata与P.expansum孢子萌发的抑制并未进一步增强，与15%浓度纳米氧化锌相比，差异不显著（p＜0.05）。

2.3 纳米氧化锌处理对损伤接种病斑直径的影响

纳米氧化锌处理可有效抑制损伤接种苹果病斑直径的扩展，其中以浓度为5%时的处理效果最好，对损伤接种A.alternata（图3A）和P.expansum（图3B）病斑直径的抑制分别为同期对照的23.76%和34.68%。但随着浓度的升高，A.alternata病斑直径并没有减小，且高浓度对病斑直径的抑制效果差异不显著（p＜0.05）。同样，5%～20%的纳米氧化锌处理均能显著减小损伤接种P.expansum苹果的病斑直径，各处理病斑直径均明显低于对照，其中15%和20%浓度的纳米氧化锌处理后，苹果病斑直径分别为对照的43.12%和43.55%，但二者之间无显著差异。

图3 纳米氧化锌处理对损伤接种A.alternata（A）和P.expansum（B）苹果病斑直径的影响Fig.3 Effects of nano-zinc oxide on lesion diameters of apple inoculated with A.alternata（A）and P.expansum（B）

3 讨论

本研究结果表明，纳米氧化锌处理可有效的抑制A.alternate和P.expansum的菌落生长和孢子萌发。尤其菌落生长的结果发现随着纳米氧化锌的浓度的增加，其对两种真菌的抑制效果亦显著增加，且纳米氧化锌对A.alternate的抑制作用较P.expansum强，可见纳米氧化锌对不同病原物的抑制作用存在差异，这可能是由于不同病原物对其的敏感性不同或纳米氧化锌对不同病原物的作用方式不同。Lili等[11]研究发现纳米ZnO对两种植物真菌B.cinerea和P.expansum的抗菌机制不同，他们认为纳米ZnO是通过破坏细胞的功能和引起真菌菌丝变形来抑制B.cinerea的生长，而对P.expansum则是通过抑制分生孢子梗和分生孢子的生长来抑制其生长。而Haghighi等[17]的研究也表明TiO2/ZnO纳米复合材料能够在可见光下有效地光降解白念珠菌的生物膜从而抑制白念珠菌的繁殖。另外何临海等[18]还发现纳米ZnO对其他真菌具有良好的抗菌作用，但其具体作用机理尚需进一步研究。

纳米材料因其粒径及各种特殊的性质，已广泛应用于催化、生物医药、精细化工等多个行业，其在果蔬防腐保鲜上的应用已成为目前的研究热点。Maneerat等[19]用纳米TiO2粉末和涂有TiO2的塑料薄膜对P.expansum和果实进行实验，将青霉菌孢子和TiO2粉末均加入到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）中，发现光催化型TiO2能够有效减少病原真菌孢子的萌发。另外，随着TiO2添加量的增加，它通过光催化反应抑制青霉菌的能力越强，培养基中活的菌落数越少，且无论选择不同种类的果实接种扩展青霉，纳米TiO2粉末和涂有TiO2的膜都表现出了抗真菌活性，控制了果实的腐烂。此结果说明二氧化钛光催化反应对扩展青霉显示了抗菌活性，其对控制采后病害存在巨大潜力。本研究结果显示，纳米氧化锌处理可抑制损伤接种苹果果实的青霉病和黑斑病的病斑扩展，其中5%的纳米ZnO对苹果青霉病和黑斑病的抑制效果最好，随着浓度的增大，抑制效果并没有增强，这可能与纳米ZnO的作用机理[20]有关，即在一定浓度下，随着纳米ZnO质量浓度的提高，光催化作用及锌离子溶出原理增强，二者之间也具有协同或相加作用从而发挥更强的抗菌作用，但超过一定浓度后，纳米氧化锌的凝聚作用也增强，使得局部锌离子浓度降低，反而影响了抗菌作用的发挥。另外高浓度纳米氧化锌可能影响果实的生理状态而降低了对病原物的抗性，具体原因还需进一步探讨。

4 结论

4.1 5%～20%的纳米ZnO均能抑制A.alternate和P.expansum菌落生长，且抑制效果随着浓度的增加而增加，对A.alternate的抑制效果优于P.expansum。

4.2 纳米ZnO可明显抑制A.alternate和P.expansum的孢子萌发，且作用效果不同。纳米ZnO浓度从5%增加到20%时，A.alternate的孢子萌发率从39.1%降到12.6%，而P.expansum在15%时孢子萌发率最低，仅为5.4%。

4.3 纳米氧化锌处理可抑制损伤接种A.alternata和P.expansum苹果果实的病斑扩展，在纳米ZnO浓度为5%～20%范围内，抑制效果并没有随浓度的升高而增强，其中，5%的纳米氧化锌对苹果青霉病和黑斑病的控制效果最好。

综上所述，虽纳米ZnO在果蔬采后病害控制中具有潜在的应用价值，但其具体作用机理及采后规范化应用技术还需进一步深入研究。

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Effects of nano-zinc oxide treatment on black spot and blue mold of postharvest apple

LIU Jin-jin1，LI Yong-cai1，*，LIU Chang-ning2
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.College of Chemical and Biological Engineering，Lanzhou Jiaotong University，Lanzhou 730070，China）

The effect of nano-zinc oxide at different concentrations against A.alternata and P.expansum of pathogenic bacteria in postharvest apple was demonstrated.Results indicated that nano-zinc oxide inhibited significantly the mycelium growth of A.alternata and P.expansum，and the inhibition efficacy was greatly enhanced when the concentration of nano-zinc oxide was increased.The inhibited ratio of 20%of nano-zinc oxide was respectively up to 86.85%and 49.60%，the former inhibitory effect was significantly better than the latter.The spore germination of A.alternata were 87.37%lower than the control after treatment with 20%zinc oxide.While the concentration of 15%zinc oxide treatment on P.expansum spore germination，the germination rate had dropped by 94.56%compared with the control.Lesion diameter of apple inoculated with A.alternata and P.expansum were decreased by nano-zinc oxide treatment when concentration at 5%showed the most effective，the lesion diameter reduced by 76.24%and 65.32%compared with the control.The higher concentration treatment did not increase the effect.It was suggested that nano-zinc oxide treatment could directly inhibit pathogens to decrease black spot and blue mold of postharvest apple.

apple；nano-zinc oxide；alternaria alternata；penicillium expansum

TS255.3

A

1002-0306（2014）04-0327-04

2013－05－27 *通讯联系人

刘瑾瑾（1989-），女，硕士研究生，研究方向：采后生物学。