响应面法优化毛叶藜芦环巴胺的提取工艺

温 文，薛 兵，康静静，刘崇波，温辉梁，*

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047；2.南昌航空大学环境与化学工程学院，江西南昌330063）

响应面法优化毛叶藜芦环巴胺的提取工艺

温 文1，薛 兵1，康静静1，刘崇波2，温辉梁1，*

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047；2.南昌航空大学环境与化学工程学院，江西南昌330063）

采用响应面法优化了从毛叶藜芦中提取环巴胺的条件。在单因素实验的基础上选取提取液料比，提取时间和提取温度为随机因子，以环巴胺提取量为响应值，建立三因素三水平Box-Behnken中心组合设计，并建立数学模型对响应值进行分析。结果表明，提取液料比、提取时间和提取温度对环巴胺的提取量都有极显著（p＜0.01）的影响，并确定了最佳的提取工艺参数为：提取液料比9∶1（mL/g），提取时间10.0h，提取温度48.0℃。在此优化条件下，提取10.0g毛叶藜芦得到环巴胺的理论量为9.38mg，实际提取量为9.19mg，相对误差为2.02%。

环巴胺，响应面法，优化

藜芦为百合科植物，为有毒中药，世界上约有40种，据《中国植物志》记载，我国有其中13种和1个变种[1]。我国盛产藜芦，作为中药用于中风痰壅，癫痫、喉痹不通，及疥癣和恶疮[2-4]。而通过长期研究，Keeler等[5]在羊群食用的藜芦属植物山藜芦（Veratrum californicum）中找到了一种甾体类生物碱环巴胺。直到90年代中期，环巴胺被发现是一种Hedgehog信号通路的抑制剂[6]，Hedgehog信号通路的突变与多种肿瘤的发病有关联，人们发现环巴胺对多种肿瘤如母髓质细胞瘤、基底细胞癌、神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、小细胞肺癌、消化道肿瘤、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌等均有显著的抑制活性[7]，对银屑病也有疗效[8]。因此，以环巴胺开发新型抗癌药物在国内外已经成为研究热点，环巴胺已经成为新药开发的重要研究目标。

目前环巴胺的来源主要有三种途径，一是从植物中提取[9]，虽然含量较低，但是藜芦属植物在我国含量丰富，提取的方法经济快速；二是全合成，全合成的过程复杂且立体选择性差，产率很低，仅有1%左右[10]；三是半合成，通过对具有类似环巴胺结构的化合物进行化学转化或者结构改造。张卫东[11]对还原介芬胺得到环巴胺的方法进行了改进，提高了产率，但是没有避免使用水合肼和高温（200℃），条件苛刻不适合大量反应，环巴胺的大量获得还是受到了限制。

为了增加环巴胺的抗肿瘤活性，人们对环巴胺进行了一系列衍生，包括扩环，环巴胺的3-位羟基氧化[12]，N-原子烷基化[13]细胞实验发现部分衍生物对Shh阻断作用有显著增加。Alfredo C C[14]将扩环后化合物的3-位羟基氧化后再衍生出系列产品，然后将A环内的双键还原得到的新化合物的活性是还原前的10～30倍；同样对环巴胺进行相同处理达到的环巴胺衍生物活性是环巴胺的20倍。

本文对毛叶藜芦中的环巴胺进行提取优化，并在单因素实验的基础上进行响应面法对影响环巴胺提取量的主要因素进行分析，从而确定最优提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

毛叶藜芦 四川荷花池中药材专业批发市场肖草药中药行，产地四川；甲醇 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；无水碳酸钠 分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；三氟乙酸 分析纯，天津市大茂化学试剂厂；乙腈 色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。

JJ-1型磁力搅拌器 常州国华电器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；JJ-200型电子天平 常熟双杰测试仪器厂；岛津LC-10AT型高效液相色谱仪 日本岛津制造所。

1.2 实验方法

1.2.1 环巴胺高效液相色谱检测条件 运用高效液相色谱对提取出来的环巴胺进行检测，其最优条件为：色谱柱：WATO-54275 waters C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：0.01%三氟乙酸（A）和乙腈（B），梯度洗脱：0～16min（90%～65%A）；分析时长：16min；流速：1.0mL/min；检测波长：215nm；柱温：25℃。

1.2.2 环巴胺标准曲线的绘制 配制浓度分别为：0.125、0.25、0.5、1、2mg/mL的环巴胺标准品，利用高效液相色谱测定紫外吸收。

1.2.3 环巴胺提取量的计算 由高效液相色谱测得的峰面积根据标准曲线得出环巴胺浓度后，环巴胺含量按下式计算：

环巴胺含量（mg）=测量浓度（mg/mL）×样品体积（mL）

1.2.4 单因素实验设计 将10g毛叶藜芦粉碎，以甲醇为提取溶剂，在液料比4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1（mL/g），提取时间2、4、6、8、10、12h，提取温度25、30、35、40、45、50℃的条件下进行提取，再将提取液用旋转蒸发仪旋干，得到粗提物后用甲醇将粗提物定容于10mL容量瓶中，并用高效液相色谱进行检测分析。

1.2.5 响应面实验设计 在单因素实验的基础上，用Deign-Expert软件进行响应面法的提取优化设计，并对结果进行分析[15]。以环巴胺提取量为指标，采用3因素3水平的Box-Behnken的中心设计组合[16]，对液料比、提取时间、提取温度三个因素进行优化。因素水平表见表1。

表1 Box-Behnken的中心组合因素水平表Table.1 Factors and levels of Box-Behnken central component experiments design

1.2.6 数据处理 本实验用Deign-Expert软件进行响应面法的提取结果进行分析，得出各因素对环巴胺提取的影响程度以及最优的提取工艺参数。

2 结果与讨论

2.1 环巴胺标准曲线

环巴胺浓度为x，各个浓度紫外吸收峰面积为y，得到标准曲线为：y=0.7814x+0.0007，R2=0.9997（图1）。

图1 环巴胺标准曲线Fig.1 Cyclopamine standard curve

2.2 环巴胺提取的单因素实验

2.2.1 提取液料比对环巴胺提取量的影响 固定提取温度为30℃，提取时间为10h对环巴胺提取量进行分析。从图2中可以看出，随着液料比的增大，环巴胺的提取量逐步增加，在液料比为8∶1时达到最大，再增加液料比，环巴胺的提取量变小。在最初时，随着液料比变大，环巴胺在甲醇中的溶解量逐步增大，而在液料比达到8∶1之后，在提取时毛叶藜芦中同属于生物碱的藜芦胺与环巴胺呈现竞争关系，在此液料比之后藜芦胺竞争性更强，使得环巴胺提取量变少，故选择提取液料比为8∶1。

图2 液料比对环巴胺提取量的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on cyclopamine extraction

2.2.2 提取时间对环巴胺提取量的影响 固定提取液料比为8∶1，提取温度为30℃对环巴胺提取量进行分析。从图3可以看出，随着提取时间的加长，环巴胺的提取量增加，在10h时达到最大，但是之后随之减小，是因为提取时间过长，使得环巴胺分解而降低得率，故选择提取时间为10h。

图3 提取时间对环巴胺提取量的影响Fig.3 Effect of time on cyclopamine extraction

2.2.3 提取温度对环巴胺提取量的影响 固定提取液料比为8∶1，提取时间为10h对环巴胺提取量进行分析。从图4中可以看出，随着温度的提高，环巴胺的提取量也在增大，这说明环巴胺在溶剂中的溶解性增大，但考虑到环巴胺在高温下容易变质，而且提取量上升幅度已经很小，从节能和防止变质的基础考虑，最佳提取温度为45℃。

2.3 响应面法优化环巴胺的提取条件

图4 提取温度对环巴胺提取量的影响Fig.4 Effect of time on cyclopamine extraction

实验设计共有17个点，其中12个析因点，5个中心点。实验设计方案和结果见表2。

对响应面结果进行多元回归拟合，从而得到响应回归方程为：

Y=9.09+0.59A+0.28B+0.22C+0.26AB+0.46AC+ 0.43BC-0.76A2-0.72B2-0.48C2。

回归统计分析结果见表3。从表3中可以看出，以环巴胺提取量为响应值时，模型p＜0.0001，表明该二次方程模型极显著。同时失拟项p=0.5258＞0.1，不显著，模型拟合度较好。该分析统计结果说明实验方法是可靠的，能很好的描述实验结果，用该方程代替真实的实验点进行分析是可行的。

各因素对环巴胺提取率的影响程度大小依次为：A（提取液料比）（p＜0.0001，极显著）＞B（提取时间）（p=0.0009，极显著）＞C（提取温度）（p=0.0035，极显著）。由方差分析可知，AB、BC、AC之间交互作用都极显著，即提取液料比与提取时间、提取液料比与提取温度、提取温度与提取时间的交互作用对环巴胺提取量都有极显著的影响，绘制响应曲面图，如图5～图7所示。

表2 Box-Behnken实验设计及其结果Table.2 Arrangement and results of the three-variable/threelevel central composite design

表3 二次多项模型方差分析表Table.3 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

由图5可知，液料比（A）与时间（B）的等高线呈椭圆形，响应面走势陡峭，说明一次项A、B对Y有极显著的影响。环巴胺的提取量随着提取液料比增大和提取时间加长先增大后减少，且提取量在提取液料比约为8.5∶1提取时间约为10.5h时候达到最大；同理，由图6可知，一次项A、C对Y有极显著影响，提取量在提取料液比约为8.5∶1提取温度约为45℃时达到最大；由图7可知，一次项B、C对Y有极显著的影响，提取量在提取时间约为10.5h提取温度约为45℃时达到最大。

图5 提取液料比与提取时间交互作用对环巴胺提取量影响的响应面图Fig.5 Response surface graph of effct of liquid-to-material ratio and extraction time interaction on the cyclopamine extraction

图6 提取液料比与提取温度交互作用对环巴胺提取量影响的响应面图Fig.6 Response surface graph of effct of liquid-to-material ratio and extraction temperature interaction on the cyclopamine extraction

图7 提取时间与提取温度交互作用对环巴胺提取量影响的响应面图Fig.7 Response surface graph of effct of extraction time and extraction temperature interaction on the cyclopamine extraction

由软件分析得出优化的参数为：提取液料比为9.11∶1（mL/g）；提取时间为10.31h；提取温度为48.36℃，此时环巴胺提取量为9.38mg。为了检验响应面法优化环巴胺提取工艺的可靠性，进行验证实验，考虑到实际操作性，将优化后的工艺参数调整为料液比9∶1（mL/g）、提取时间为10.0h、提取温度为48.0℃。进行三次平行实验，环巴胺平均提取量为9.19mg，相对误差为2.02%，说明响应面法得到的模型参数准确可靠。

3 结论

本实验通过响应面法优化了毛叶藜芦中环巴胺的提取工艺。由方差分析得知，各因素对环巴胺的提取量有极显著的影响（p＜0.01），影响次序为：A（提取料液比）＞B（提取时间）＞C（提取温度）。最优工艺参数调整为料液比9∶1（mL/g）、提取时间为10.0h、提取温度为48.0℃，环巴胺平均提取量为9.19mg，与理论值9.38mg相差2.02%，两者吻合较好，说明响应面法得到的模型参数准确可靠。

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Optimization of cyclopamine extraction from Veratrum grandiflorum Loes by response surface methodology

WEN Wen1，XUE Bing1，KANG Jing-jing1，LIU Chong-bo2，WEN Hui-liang1，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.School of Environment and Chemical Engineering，Nanchang Hangkong University，Nanchang 330063，China）

Response surface methodology was used to optimize the extraction conditions of cyclopamine from Veratrum grandiflorum.Based on single factor experiments，the liquid-to-material ratio extraction time，extraction temperature were chosen as causal factors and the extraction of cyclopamine was chosen as response value which was then analyzed by models.In this way，the three-factors-three-levels Box-Behnken central composition experiments were designed.Results showed that liquid-to-material ratio，extraction time，extraction temperature had significant effects（p＜0.01）on extraction of cyclopamine.Optimal conditions for achieving the high extraction of cyclopamine were liquid-to-material ratio 9∶1（mL/mg），extraction time 10.0h，extraction temperature 48.0℃. Under these optimized conditions，with 10.0g raw materials extraction get cyclopamine 9.38mg in the abstract，the actual extraction of cyclopamine was 9.19mg，and the model prediction was worth 2.02 percent error.

cyclopamine；response surface methodology；optimization

TS201.1

B

1002-0306（2014）04-0219-04

2013－06－06 *通讯联系人

温文（1988-），男，硕士研究生，研究方向：食品科学。

国家自然科学基金资助项目（21264011，20961007）。